Efectos nocivos del herbicida 2,4-D

Se evaluaron los efectos genotóxicos a largo plazo de dos formulaciones de herbicidas auxínicos, a saber, DMA ® a base de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) al 58,4 % y Banvel ® a base de dicamba (DIC) al 57,7 % en Cnesterodon decemmaculatus . Las lesiones primarias de ADN se analizaron mediante la metodología de electroforesis en gel unicelular. Se ensayaron dos concentraciones subletales para cada herbicida correspondientes al 2,5% y 5% de la CL50 96hvalores. Los peces estuvieron expuestos a 25,2 y 50,4 mg/L o 41 y 82 mg/L para 2,4-D y DIC, respectivamente. Estos expuestos continuamente durante 28 días con reemplazo de las soluciones de prueba cada 3 días. La genotoxicidad se evaluó en diez individuos de cada punto experimental al inicio del período de exposición (día 0) y a los 7, 14, 21 y 28 días posteriores. Los resultados demostraron por primera vez que la formulación basada en 2,4-D DMA ® indujo roturas de la cadena primaria de ADN después de 7 a 28 días de exposición de C. decemmaculatus independientemente de su concentración. Por otro lado, la formulación a base de DIC Banvel ® ejerció su efecto genotóxico tras exposición durante 7-14 días y 7 días de 2,5 y 5% LC50 96h, respectivamente. El presente estudio representa la primera evidencia de lesiones primarias en el ADN inducidas por dos herbicidas auxínicos ampliamente empleados en C. decemmaculatus, a saber, 2,4-D y DIC, luego de una exposición a largo plazo.

Long-term genotoxic effects of two auxinic herbicide formulations, namely, the 58.4% 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D)-based DMA® and the 57.7% dicamba (DIC)-based Banvel® were evaluated on Cnesterodon decemmaculatus. Primary DNA lesions were analyzed by the single-cell gel electrophoresis methodology. Two sublethal concentrations were tested for each herbicide corresponding to 2.5% and 5% of the LC5096h values. Accordingly, fish were exposed to 25.2 and 50.4 mg/L or 41 and 82 mg/L for 2,4-D and DIC, respectively. Fish were continuously exposed for 28 days with replacement of test solutions every 3 days. Genotoxicity was evaluated in ten individuals from each experimental point at the beginning of the exposure period (0 day) and at 7, 14, 21 and 28 days thereafter. Results demonstrated for first time that 2,4-D-based formulation DMA® induced primary DNA strand breaks after 7-28 days exposure on C. decemmaculatus regardless its concentration. On the other hand, DIC-based formulation Banvel® exerted its genotoxic effect after exposure during 7-14 days and 7 days of 2.5 and 5% LC5096h, respectively. The present study represents the first evidence of primary DNA lesions induced by two widely employed auxinic herbicides on C. decemmaculatus, namely 2,4-D and DIC, following long-term exposure.

El ácido químico 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) se usa en la agricultura como herbicida. Su uso intensivo tiene un efecto adverso sobre el medio ambiente. Este estudio consistió en examinar la degradación del compuesto 2,4-D por el hongo filamentoso Umbelopsis isabellina. Después de 5 días de incubación, se encontró que el 98% del herbicida (agregado a 25 mg L -1 ) se había eliminado. La eliminación de 2,4-D por U. isabellina se relacionó con la formación de 2,4-diclorofenol (2,4-DCP), lo que resultó en una disminución del 60% en la toxicidad de la muestra hacia las larvas de Artemia franciscana. El metabolismo de 2,4-D fue inhibido por la adición de metirapona, un conocido inhibidor del citocromo P450. Proporciona evidencia de que el sistema del citocromo P450 está involucrado en el metabolismo de 2,4-D en U. isabellina.

The chemical 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) is used in agriculture as a herbicide. Its intensive use has an adverse effect on the environment. This study involved examining the degradation of 2,4-D compound by the filamentous fungus Umbelopsis isabellina. After 5 days of incubation, 98% of the herbicide (added at 25 mg L-1) was found to be removed. The elimination of 2,4-D by U. isabellina was connected with the formation of 2,4-dichlorophenol (2,4-DCP), which resulted in a 60% decrease in the sample toxicity toward Artemia franciscana larvae. The metabolism of 2,4-D was inhibited by the addition of metyrapone, a known cytochrome P450 inhibitor. It provides evidence that cytochrome P450 system is involved in 2,4-D metabolism in U. isabellina.

El objetivo del estudio actual es evaluar los posibles efectos mutagénicos de eritrocitos en renacuajos de Lithobates catesbeianus expuestos a agua contaminada con 2,4-D. Para ello, los renacuajos fueron expuestos a una concentración de herbicida predictiva y ambientalmente relevante (1,97 mg/L), que es probable que se encuentre en ambientes lénticos formados por escurrimientos superficiales de agua en áreas de pastoreo donde se aplicó el herbicida. La prueba de micronúcleos, así como las pruebas de otras anomalías nucleares, se realizó después de 3, 5 y 9 días de exposición (de). No se registraron cambios en la biomasa y longitud boca-cloaca ni interferencia en el desarrollo larvario de los animales (en los tres tiempos evaluados). Sin embargo, los renacuajos expuestos al 2,4-D mostraron el mayor número total de anomalías nucleares, así como la mayor frecuencia de eritrocitos binucleados y núcleos reniformes (poco después del 3 de). La frecuencia de micronúcleos también fue mayor en animales expuestos a 2,4-D (en el 3°, 5° y 9° de), así como la frecuencia de células binucleadas (3°, 5° y 9° de) presentando muescas (9° de) y núcleos ampollados (9º de) en comparación con los del control, después de 5 y 9 días de exposición. Por lo tanto, el presente estudio es pionero en demostrar que el 2,4-D tiene un efecto mutagénico en renacuajos de L. catesbeianus, incluso en bajas concentraciones (relevantes para el medio ambiente) y durante un corto período de tiempo, hecho que puede conducir a pérdidas directas en poblaciones de anuros que viven en áreas adyacentes a aquellas sujetas a la aplicación del herbicida 2,4-D.

The aim of the current study is to assess possible erythrocyte mutagenic effects on Lithobates catesbeianus tadpoles exposed to water contaminated with 2,4-D. In order to do so, tadpoles were exposed to a predictive and environmentally relevant herbicide concentration (1.97 mg/L), which is likely to be found in lentic environments formed by superficial water runoffs in pasture areas where the herbicide was applied. The micronucleus test, as well as tests for other nuclear abnormalities, was conducted after 3, 5, and 9 days of exposure (d.e.). Changes in the biomass and mouth-cloaca length or interference in the larval development of the animals (in the three evaluated times) were not recorded. However, tadpoles exposed to 2,4-D showed the highest total number of nuclear abnormalities, as well as the highest frequency of binucleated erythrocytes and kidney-shaped nuclei (shortly after 3 d.e.). The micronucleus frequency was also higher in animals exposed to 2,4-D (in the 3rd, 5th, and 9th d.e.), as well as the frequency of binucleated cells (3rd, 5th, and 9th d.e.) presenting notched (9th d.e.) and blebbled (9th d.e.) nuclei in comparison to those of the control, after 5 and 9 days of exposure. Therefore, the current study is a pioneer in showing that 2,4-D has a mutagenic effect on L. catesbeianus tadpoles, even at low concentrations (environmentally relevant) and for a short period of time, a fact that may lead to direct losses in anuran populations living in areas adjacent to those subjected to 2,4-D herbicide application.

El ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) es uno de los herbicidas selectivos más utilizados en el mundo. Varios estudios epidemiológicos han encontrado una asociación entre la exposición al 2,4-D y el linfoma no Hodgkin (LNH), pero estos resultados son inconsistentes y controvertidos. Un metanálisis anterior no encontró una asociación clara en general, pero no examinó específicamente los grupos de alta exposición. Realizamos una revisión sistemática y un metanálisis de los estudios epidemiológicos revisados ​​por pares de las asociaciones entre 2,4-D y LNH, con un enfoque particular en los grupos de alta exposición y evaluaciones de heterogeneidad, dosis-respuesta y sesgo. Se incluyeron un total de 12 estudios observacionales, 11 estudios de casos y controles y un estudio de cohortes. El riesgo relativo resumido de LNH usando los resultados del estudio comparando sujetos que alguna vez estuvieron expuestos a 2, versus nunca expuestos a 2, 4-D fue 1,38 (intervalo de confianza (IC) del 95 %, 1,07-1,77). Sin embargo, en análisis centrados en los resultados de grupos altamente expuestos, el riesgo relativo total de LNH fue de 1,73 (IC del 95 %, 1,10-2,72). No se observó un sesgo claro basado en el diseño del estudio, la metodología de evaluación de la exposición o la clasificación errónea de los resultados. En general, estos hallazgos brindan nueva evidencia de una asociación entre el LNH y la exposición al herbicida 2,4-D.

2,4-Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) is one of the most commonly used selective herbicides in the world. A number of epidemiology studies have found an association between 2,4-D exposure and non-Hodgkin lymphoma (NHL) but these results are inconsistent and controversial. A previous meta-analysis found no clear association overall but did not specifically examine high-exposure groups. We conducted a systematic review and meta-analysis of the peer-reviewed epidemiologic studies of the associations between 2,4-D and NHL, with a particular focus on high-exposure groups, and evaluations of heterogeneity, dose-response, and bias. A total of 12 observational studies, 11 case-control studies, and one cohort study, were included. The summary relative risk for NHL using study results comparing subjects who were ever versus never exposed to 2,4-D was 1.38 (95% confidence interval (CI), 1.07-1.77). However, in analyses focusing on results from highly exposed groups, the summary relative risk for NHL was 1.73 (95% CI, 1.10-2.72). No clear bias based on study design, exposure assessment methodology, or outcome misclassification was seen. Overall, these findings provide new evidence for an association between NHL and exposure to the herbicide 2,4-D.

El uso extensivo del ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) en la agricultura es una fuente importante de contaminación del agua y el suelo. La toxicidad de los herbicidas de uso común para los organismos fotosintéticos planctónicos no objetivo aún no se ha descrito completamente. Por lo tanto, determinamos el efecto de las concentraciones subinhibitorias de 2,4-D sobre el alga clorofícea Ankistrodesmus falcatus y sobre una cepa toxigénica de la cianobacteria Microcystis aeruginosa . Se cuantificaron el crecimiento de la población, los pigmentos fotosintéticos, los biomarcadores macromoleculares (carbohidratos, lípidos y proteínas) y las enzimas antioxidantes (catalasa [CAT], glutatión peroxidasa [GPx] y superóxido dismutasa [SOD]) y la respuesta integrada de biomarcadores (IBR) fue calculado. ExploraciónTambién se realizaron observaciones con microscopio electrónico (SEM) y microscopio electrónico de transmisión (TEM). La concentración inhibitoria media (IC 50 ) de 96 h para 2,4-D fue de 1353,80 y 71,20 mg L − 1 para el alga y la cianobacteria, respectivamente. Bajo estrés con 2,4-D, ambos organismos aumentaron la concentración de pigmentos y macromoléculas , modificaron la actividad de todas las enzimas evaluadas y exhibieron alteraciones ultraestructurales. M. aeruginosa también aumentó la producción de microcistinas, y A . falcatus mostró alteraciones morfológicas externas. el alga verdefue tolerante a altas concentraciones del herbicida, mientras que la cianobacteria exhibió una sensibilidad comparable a otros fitoplancton. Ambos organismos fueron tolerantes a concentraciones comparativamente altas del herbicida; sin embargo, los efectos negativos sobre los biomarcadores evaluados y la morfología celular fueron significativos. Además, la estimulación de la producción de cianotoxinas bajo estrés químico podría aumentar el riesgo para la biota en ambientes acuáticos , relacionado con la contaminación por herbicidas en ecosistemas eutróficos de agua dulce.

The extensive use of 2,4-dichlorophenoxiacetic acid (2,4-D) in agriculture is an important source of pollution to water and soil. Toxicity of commonly used herbicides to non-target, planktonic photosynthetic organisms has not been described completely yet. Therefore, we determined the effect of subinhibitory 2,4-D concentrations on the Chlorophycean alga Ankistrodesmus falcatus and on a toxigenic strain of the cyanobacterium Microcystis aeruginosa. Population growth, photosynthetic pigments, macromolecular biomarkers (carbohydrates, lipids, and protein), and antioxidant enzymes (catalase [CAT], glutathione peroxidase [GPx], and superoxide dismutase [SOD]) were quantified, and the integrated biomarker response (IBR) was calculated. Scanning electron microscope (SEM) and transmission electron microscope (TEM) observations were also performed. The 96-h median inhibitory concentration (IC50) for 2,4-D was 1353.80 and 71.20 mg L− 1 for the alga and the cyanobacterium, respectively. Under 2,4-D stress, both organisms increased pigments and macromolecules concentration, modified the activity of all the evaluated enzymes, and exhibited ultrastructural alterations. M. aeruginosa also increased microcystins production, and A. falcatus showed external morphological alterations. The green alga was tolerant to high concentrations of the herbicide, whereas the cyanobacterium exhibited sensitivity comparable to other phytoplankters. Both organisms were tolerant to comparatively high concentrations of the herbicide; however, negative effects on the assessed biomarkers and cell morphology were significant. Moreover, stimulation of the production of cyanotoxins under chemical stress could increase the risk for the biota in aquatic environments, related to herbicides pollution in eutrophic freshwater ecosystems.

El glifosato, el ingrediente principal de Roundup®, es el herbicida más utilizado en el mundo. También se usa en combinación con otro herbicida eficaz, el 2,4-D, en la formulación llamada Enlist Duo®. La EPA aprobó el uso de Enlist Duo® en ciertos cultivos, incluidos los modificados genéticamente para que sean resistentes a ambos herbicidas. El aumento significativo previsto en el uso de estos herbicidas despertó la preocupación del público en general porque ambos compuestos han sido clasificados como posible o probablemente cancerígenos. Dado que los herbicidas se aplican directamente a la vegetación, la seguridad de los organismos que entran en contacto con los herbicidas está en riesgo. En este estudio de toxicidad, se investigaron las respuestas de las lombrices de tierra expuestas a diversas concentraciones de 2,4-D, glifosato o ambos. Los resultados de los estudios de contacto directo muestran efectos graves del 2,4-D en los gusanos, incluida la muerte. A pesar de observar efectos nocivos en los ensayos de contacto directo, no observamos una diferencia significativa en las tasas de mortalidad, la salud reproductiva y el peso de las lombrices de tierra tratadas mediante la ingestión de suelo o vegetación contaminados. Como las lombrices de tierra constituyen una fuente de alimento para otros organismos, es posible la bioacumulación. También se desarrolló un método de HPLC para detectar la absorción de herbicidas en los tejidos de las lombrices de tierra. Estos métodos fueron adecuados para analizar lombrices obtenidas de suelo y plantas tratadas con 2,4-D, glifosato o ambos. El análisis de HPLC mostró la absorción tanto de 2,4-D como de glifosato, pero no hubo evidencia que indicara que la presencia de 2,4-D cambiara la absorción de glifosato.

Glyphosate, the main ingredient in Roundup®, is the most widely used herbicide in the world. It is also used in combination with another effective herbicide, 2,4-D, in the formulation called Enlist Duo®. The EPA approved the use of Enlist Duo® on certain crops including those genetically modified to be resistant to both herbicides. The predicted significant increase in the use of these herbicides raised concerns from the general public because both compounds have been classified as possibly or probably carcinogenic. Since herbicides are applied directly to vegetation, the safety of organisms that come in contact with the herbicides is at risk. In this toxicity study, the responses of earthworms exposed to various concentrations of 2,4-D, glyphosate, or both were investigated. Results of direct contact studies show severe effects of 2,4-D on worms, including death. Despite seeing ill effects in direct contact trials, we saw no significant difference in the mortality rates, reproductive health, and weight of the earthworms treated via ingestion of contaminated soil or vegetation. As earthworms constitute a food source for other organisms, bioaccumulation is possible. An HPLC method to detect herbicide uptake in earthworm tissues was also developed. These methods were suitable for analyzing worms obtained from soil and plants treated with 2,4-D, glyphosate, or both. HPLC analysis showed uptake of both 2,4-D and glyphosate but no evidence indicating that the presence of 2,4-D changed the uptake of glyphosate.

El herbicida ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) se usa en todo el mundo. Se ha asociado con una variedad de toxicidades en roedores. En este estudio, a ratones macho se les administró por vía oral 2,4-D en dosis de 50, 100 o 200 mg/kg/día para investigar la toxicidad testicular y los posibles mecanismos de acción. La exposición a altas concentraciones de 2,4-D (100 y 200 mg/kg/día) durante 14 días consecutivos causó alteración espermatogénica y destrucción del epitelio seminífero. Además, la administración de 2,4-D (100 y 200 mg/kg/día) aumentó la formación del producto de peroxidación lipídica malondialdehído y disminuyó la actividad de las enzimas antioxidantes superóxido dismutasa y catalasa en los testículos. Así mismo, la exposición a 2,4-D reguló al alza la expresión de la proteína p53 y Bax y reguló a la baja la expresión de la proteína Bcl-2 en los testículos. Estos resultados demuestran que el estrés oxidativo y la apoptosis pueden estar involucrados en la toxicidad testicular inducida por altas concentraciones de 2,4-D en ratones.

The herbicide 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) is used worldwide. It has been associated with a variety of toxicities in rodents. In this study, male mice were orally administered 2,4-D at 50, 100 or 200 mg/kg/day to investigate testicular toxicity and the possible mechanisms of action. Exposure to 2,4-D at high concentrations (100 and 200 mg/kg/day) for 14 consecutive days caused spermatogenic disruption and seminiferous epithelial destruction. Furthermore, 2,4-D administration (100 and 200 mg/kg/day) increased the formation of the lipid peroxidation product malondialdehyde and decreased activities of the antioxidant enzymes superoxide dismutase and catalase in the testis. Moreover, 2,4-D exposure up-regulated the expression of p53 and Bax protein and down-regulated the expression of Bcl-2 protein in the testis. These results demonstrate that oxidative stress and apoptosis may be involved in testicular toxicity induced by high concentrations of 2,4-D in mice.

Evaluamos la exposición al ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) en cuatro municipios con y sin estatutos de pesticidas cosméticos en Columbia Británica, Canadá. Reclutamos a un niño (de 1,5 a 5 años) y un adulto de 10 hogares en cada ciudad, que proporcionaron muestras de orina en mayo y junio de 2009. Ningún hogar había usado pesticidas durante los 7 días anteriores a la recolección de muestras. Cuantificamos el 2,4-D urinario mediante LC/MS/MS. Las cantidades de 2,4-D en la orina fueron similares en todas las ciudades y por debajo de los equivalentes de biomonitoreo correspondientes a las dosis de referencia en los Estados Unidos de América y Canadá. Cuando las orinas de adultos y niños se analizaron juntas en modelos de regresión lineal de efectos mixtos, el logaritmo natural del 2,4-D en orina se asoció significativamente con tener una dieta de ⩾50 % de alimentos orgánicos (β=-0,6 (0,3) μg/l, P =0,05). Sin transformación logarítmica natural, la concentración media de 2,4-D en la orina entre los que comieron ⩾50 % de alimentos orgánicos (n=12) fue de 1,4 μg/l frente a 1,5 μg/l para los demás (n=59). La falta de una asociación significativa (alfa bilateral = 0,05) entre los reglamentos de pesticidas y el 2,4-D urinario podría reflejar un tamaño de muestra pequeño, la falta de exposición aguda reciente o que la exposición al 2,4-D está influenciada principalmente por las fuentes de exposición no se aborda en los estatutos. Los alimentos podrían ser una vía de exposición al 2,4-D, de acuerdo con otros estudios. La investigación futura requerirá tamaños de muestra más grandes para poder estadístico suficiente.

We evaluated 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) exposure in four municipalities with and without cosmetic pesticide bylaws in British Columbia, Canada. We recruited a child (aged 1.5-5 years) and adult from 10 households in each city, who provided urine samples in May and June, 2009. No households had used pesticides for 7 days prior to sample collection. We quantified urinary 2,4-D using LC/MS/MS. Quantities of 2,4-D in urine were similar across cities and below biomonitoring equivalents corresponding to references doses in the United State of America and Canada. When adult's and children's urines were analyzed together in linear mixed-effects regression models, natural log urinary 2,4-D was significantly associated with having a diet of ⩾50% organic food (β=-0.6 (0.3) μg/l, P=0.05). Without natural log transformation, median concentration of urinary 2,4-D among those who ate ⩾50% organic food (n=12) was 1.4 μg/l versus 1.5 μg/l for others (n=59). Lack of a significant association (two-sided alpha=0.05) between pesticide bylaws and urinary 2,4-D might reflect small sample size, lack of recent acute exposure, or that 2,4-D exposure is primarily influenced by sources of exposure not addressed through bylaws. Food might be a route of exposure to 2,4-D, consistent with other studies. Future research will require larger sample sizes for sufficient statistical power.

El ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) y sus derivados es uno de los herbicidas más utilizados en el mundo. Se han utilizado desde la década de 1940 y su popularidad parece estar aumentando. Debido a su amplio rango de aplicación y uso excesivo, se han convertido en un grave problema ya que pueden causar contaminación al medio ambiente. Se han realizado extensas investigaciones para el 2,4-D pero comparativamente pocas para sus derivados. Por lo tanto, en este documento de revisión, nos enfocamos más en los derivados de 2,4-D, incluida la sal de dimetilamina de 2,4-D y el éster de butilo de 2,4-D para comprender mejor los destinos de este pesticida en el medio ambiente. Por ello, se revisan sus propiedades físicas y químicas en base a las referencias disponibles. En este documento, también discutimos los efectos de toxicidad del 2,4-D y sus derivados en el medio ambiente. Esta revisión también describió sobre las tecnologías de tratamiento para el 2,4-D y sus derivados.

2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) and its derivatives are one of the most used herbicides in the world. They have been used since 1940s and their popularity seems to be increasing. Due to their broad range of application and excessive usage, they have becoming a serious problem as they can cause pollution to the environment the environment. Extensive researches have been done for 2,4-D but comparatively few for its derivatives. Therefore, In this review paper, we focused more on 2,4-D derivatives including 2,4-D dimethylamine salt and 2,4-D butyl ester in order to have better understanding on the fates of this pesticide in the environment. Hence, their physical and chemical properties are reviewed based on available references. In this paper, we also discussed the toxicity effects of 2,4-D and its derivatives on the environment. This review also described about the treatment technologies for 2,4-D and its derivatives.

En este trabajo se da a conocer una metodología para calcular el impacto ambiental que los pesticidas ocasionan en el medio ambiente teniendo en cuenta diferentes factores. El área de estudio elegida fue la región centro de la provincia de Santa Fe, en la localidad de San Vicente, Argentina. Se confecciono una formula denominada VIA= (ET total + TH total + CA total) x 10. Cada ítems tiene su significado, valoración correspondiente y subdivisión, en donde tenemos las diferentes características de clasificación: ecotoxicología (ET), toxicidad humana (TH) y comportamiento ambiental (CA). La suma de los valores numéricos fueron incluidas en las siguientes categorías: bajo - medio - alto - muy alto, la que nos permitió valorar cada pesticida por separado. Los resultados demuestran que la mayoría de los pesticidas utilizados son de mediana toxicidad (43.75%), seguido por los de baja y alta toxicidad (21.88%) y por último los de muy alta toxicidad (12.5%). Este es un estudio piloto donde se implemento una herramienta nueva que puede estar sujeta a cambios y mejoras.

This paper discloses a methodology to calculate the environmental impact that pesticides cause in the environment taking into account various factors. The study area was the central region of the province of Santa Fe, in the town of San Vicente, Argentina. A formula called VIA= (ET total + TH total + CA total) x 10 was formulated. Each item has its meaning, corresponding valuation and subdivision, where the different characteristics of classification are: ecotoxicology (ET), human toxicity (TH) and environmental behavior (CA). The sum of the numerical values were included in the following categories: low - medium - high - very high, which allowed us to assess each pesticide separately. The results show that most of the pesticides used are middle toxicity (43.75%), followed by low and high toxicity (21.88%) and finally the very high toxicity (12.5%). This is a pilot study where a new tool was implemented that may be subject to changes and improvements.