Detección de organismos genéticamente modificados

El maíz modificado genéticamente ha sido aprobado como pienso animal en varios países, pero la información sobre el destino in vivo del ADN y la proteína modificados genéticamente es insuficiente. El maíz modificado genéticamente Bt11 se desarrolla insertando una secuencia de ADN recombinante que codifica la proteína insecticida Cry1Ab de Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki. Se examinó la presencia del gen Cry1Ab intrínseco y recombinante del maíz mediante PCR, y de la proteína Cry1Ab mediante pruebas inmunológicas en el contenido gastrointestinal de cinco cerdos alimentados con maíz Bt11 modificado genéticamente y cinco cerdos alimentados con maíz no modificado genéticamente. Se detectaron fragmentos de zeína de maíz (242 pb), invertasa (226 pb) y de genes de ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa/oxigenasa (1.028 pb) en el contenido gastrointestinal de cerdos alimentados con maíz Bt11 y no modificado genéticamente. Se detectaron fragmentos del gen recombinante cry1Ab (110 pb y 437 pb) en el contenido gastrointestinal de los cerdos alimentados con Bt11, pero no en los cerdos de control. Ni los fragmentos intrínsecos del maíz ni los del gen cry1Ab se detectaron en la sangre periférica mediante PCR. El contenido gastrointestinal dio positivo para la proteína Cry1Ab mediante ELISA, inmunocromatografía e inmunotransferencia; sin embargo, estos métodos no funcionaron para la sangre e impidieron sacar conclusiones sobre cualquier absorción potencial de la proteína. Estos resultados sugieren que el ADN del maíz ingerido y la proteína Cry1Ab no se degradaron totalmente en el tracto gastrointestinal, como demuestra su presencia en una forma detectable mediante PCR o pruebas inmunológicas.

Genetically modified corn has been approved as an animal feed in several countries, but information about the fate of genetically modified DNA and protein in vivo is insufficient. Genetically modified corn Bt11 is developed by inserting a recombinant DNA sequence encoding insecticidal Cry1Ab protein from Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki. We examined the presence of corn intrinsic and recombinant cry1Ab gene by PCR, and the Cry1Ab protein by immunological tests in the gastrointestinal contents of five genetically modified corn Bt11-fed and five nongenetically modified corn-fed pigs. Fragments of corn zein (242 bp), invertase (226 bp) and of ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase genes (1,028 bp) were detected in the gastrointestinal contents of both Bt11 and nongenetically modified corn-fed pigs. Fragments of recombinant cry1Ab gene (110 bp and 437 bp) were detected in the gastrointestinal contents of the Bt11-fed pigs but not in the control pigs. Neither corn intrinsic nor cry1Ab gene fragments were detected in the peripheral blood by PCR. The gastrointestinal contents were positive for Cry1Ab protein by ELISA, immunochromatography, and immunoblot; however, these methods did not work for blood and precluded conclusions about any potential absorption of the protein. These results suggest that ingested corn DNA and Cry1Ab protein were not totally degraded in the gastrointestinal tract, as shown by their presence in a form detectable by PCR or immunological tests.

La producción de cultivos genéticamente modificados (GM) se concentra actualmente en unos pocos países. En 2001, el 99% de los cultivos transgénicos se producía en cuatro países: EE. UU. 68%, Argentina 11,8%, Canadá 6% y China 3%. En cuanto a los cultivos, la soja transgénica representó el 63 % del área de siembra transgénica mundial y el maíz transgénico representa el 19 %, seguida por el algodón transgénico (13 %) y la canola transgénica (5 %). En cuanto a la superficie global de siembra, la soja y el algodón transgénicos representaron el 46 % y el 20 %, respectivamente. Dos características importantes de los organismos modificados genéticamente (OGM) en 2001 fueron los cultivos tolerantes a herbicidas, que representaron el 77 % de todos los cultivos GM, mientras que el maíz Bt representó el 11 %. La legislación promulgada en todo el mundo para regular la presencia de OMG en cultivos, alimentos e ingredientes hizo necesario el desarrollo de métodos fiables y sensibles para la detección de OMG. En este artículo, se analizan los métodos basados ​​en proteínas y ADN que emplean transferencias Western, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas, tiras de flujo lateral, transferencias Southern, métodos cualitativos, cuantitativos, en tiempo real y de PCR de dilución limitante. Cuando no se disponga de información sobre secuencias genéticas modificadas, nuevos enfoques, como la espectrometría de infrarrojo cercano, podrían abordar el problema de la detección de alimentos genéticamente modificados (GM) no aprobados. La eficiencia de las estrategias de detección, identificación y confirmación debe examinarse con respecto a las tasas de falsos positivos, la desaparición de genes marcadores, el mayor uso de secuencias reguladoras específicas y el número creciente de alimentos GM.

Production of genetically modified (GM) crops is currently concentrated in just a few countries. In 2001, 99% of GM crops was produced in four countries: US 68%, Argentina 11.8%, Canada 6% and China 3%. Crop-wise, GM soybean made up 63% of global GM planting area and GM corn accounts for 19%, followed by GM cotton (13%) and GM canola (5%). In terms of the global planting area, GM soybean and cotton accounted for 46% and 20%, respectively. Two major genetically modified organisms (GMO) traits in 2001 were herbicide tolerant crops, accounted for 77% of all GM crops, while Bt maize accounted for 11%. Legislation enacted worldwide to regulate the presence of GMOs in crops, foods and ingredients, necessitated the development of reliable and sensitive methods for GMO detection. In this article, protein-, and DNA-based methods employing western blots, enzyme-linked immunosorbant assay, lateral flow strips, Southern blots, qualitative-, quantitative-, real-time- and limiting dilution-PCR methods, are discussed. Where information on modified gene sequences is not available, new approaches, such as near-infrared spectrometry, might tackle the problem of detection of non-approved genetically modified (GM) foods. The efficiency of screening, identification and confirmation strategies should be examined with respect to false-positive rates, disappearance of marker genes, increased use of specific regulator sequences and the increasing number of GM foods.

Las técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se utilizan cada vez más para la detección de cultivos modificados genéticamente (MG) en los alimentos. En este trabajo se secuencian los ADN recombinantes introducidos en siete líneas de maíz transgénico, como Event 176, Bt11, T25, MON810, GA21, DLL25 y MON802. A partir de la secuencia obtenida, se diseñaron 14 pares de cebadores para la detección de segmentos como el promotor, las regiones terminadoras y los genes constructores. Para confirmar las especificidades de los pares de cebadores diseñados, se realizó la PCR en ADN genómico extraído de maíz transgénico y no transgénico, soja transgénica y no transgénica, y otros cultivos de cereales. Dado que los pares de cebadores diseñados detectaron específicamente la presencia de los segmentos de ADN correspondientes en los cultivos MG, se concluyó que este método es útil para el cribado rápido y sencillo de cultivos MG, incluidos los no autorizados.

Polymerase Chain Reaction (PCR) techniques are increasingly used for the detection of genetically modified (GM) crops in foods. In this paper, recombinant DNAs introduced into the seven lines of GM maize, such as Event 176, Bt11, T25, MON810, GA21, DLL25, and MON802, are sequenced. On the basis of the obtained sequence, 14 primer pairs for the detection of the segments, such as promoter, terminator regions, and construct genes, were designed. To confirm the specificities of the designed primer pairs, PCR was performed on genomic DNAs extracted from GM and non-GM maize, GM and non-GM soy, and other cereal crops. Because the presence of the corresponding DNA segments was specifically detected in GM crops by the designed primer pairs, it was concluded that this method is useful for fast and easy screening of GM crops including unauthorized ones.

Se adaptó la PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) para estimar el número de copias de transgenes en callos y plantas transgénicas de maíz. Se generaron líneas de callos y plantas transgénicas derivadas de WHISKERS™ utilizando dos construcciones génicas diferentes. Estos materiales transgénicos representaban un rango de número de copias. Se estableció una «curva estándar» mezclando ADN plasmídico con ADN genómico de maíz no transgénico utilizando una relación calculada entre el gen diana y el tamaño del genoma huésped. El número de copias «estimado» en las líneas de callos y plantas mediante qRT-PCR se correlacionó con el número de copias «real» basado en el análisis Southern blot. Los resultados indicaron que existía una correlación significativa entre los dos métodos con ambas construcciones génicas. Así pues, la qRT-PCR representa un medio eficaz para estimar el número de copias en el maíz transgénico.

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) was adapted to estimate transgene copy number in transgenic maize callus and plants. WHISKERS™-derived transgenic callus lines and plants were generated using two different gene constructs. These transgenic materials represented a range of copy number. A ‘standard curve’ was established by mixing plasmid DNA with non-transgenic genomic maize DNA using a calculated ratio of target gene to host genome size. ‘Estimated’ copy number in the callus lines and plants using qRT-PCR was correlated with the ‘actual’ copy number based on Southern blot analysis. The results indicated that there was a significant correlation between the two methods with both gene constructs. Thus, qRT-PCR represents an efficient means of estimating copy number in transgenic maize.

Se desarrollaron reacciones de PCR multiplex para detectar simultáneamente los genes CryIA(b) y pat de los eventos 176, MON810, BT11 y T25 del maíz transgénico, utilizando sólo dos pares de cebadores, uno para el gen CryIA(b) y otro para el gen pat. La soja Roundup Ready puede detectarse con precisión mediante una reacción PCR multiplex utilizando cebadores conocidos, amplificando fragmentos de las secuencias NOS y epsps simultáneamente. Los eventos transgénicos como la soja Roundup Ready y el maíz GA21, entre otros, pueden cuantificarse mediante PCR en tiempo real utilizando un par de cebadores y una sonda diseñados específicamente para el recocido con la región terminal NOS. Como alternativa a la amplificación de un gen endógeno, se propone la adición de un gen extraño en un porcentaje igual al nivel de detección requerido, en una reacción paralela. Se sugiere el uso de hexano para homogeneizar grandes muestras de harina.

Multiplex PCR reactions were developed for detecting simultaneously the CryIA(b) and pat genes from events 176, MON810, BT11, and T25 of transgenic maize, using only two pairs of primers, one for the CryIA(b) gene and the other for the pat gene. The Roundup Ready soybean can be precisely detected by a multiplex PCR reaction using known primers, amplifying fragments of the NOS and the epsps sequences simultaneously. Transgenic events such as Roundup Ready soybean and GA21 maize, among others, can be quantified by real-time PCR using a pair of primers and a probe specifically designed for annealing to the NOS ending region. As an alternative to amplifying an endogenous gene, the addition of a foreign gene in a percentage equal to the required level of detection, in a parallel reaction, is proposed. The use of hexane to homogenize large flour samples is suggested.

La necesidad de monitorear y verificar la presencia y cantidad de OGM en los cultivos agrícolas y en los productos derivados de los mismos ha generado una demanda de métodos analíticos capaces de detectar, identificar y cuantificar tanto el ADN introducido como la(s) proteína(s) expresada(s) en las plantas transgénicas, porque estos componentes son considerados como los constituyentes fundamentales. Por lo tanto, varios laboratorios han desarrollado métodos basados ​​en la detección de ADN mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), o en la detección de proteínas mediante ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA). Aunque se ha avanzado mucho en el desarrollo de métodos de análisis genético, como los basados ​​en el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), están surgiendo otras tecnologías analíticas que pueden brindar soluciones a los problemas técnicos actuales en el análisis de OGM. Estos incluyen espectrometría de masas, cromatografía, espectroscopia de infrarrojo cercano, dispositivos microfabricados, tecnología de chips de ADN y análisis de OGM a nanoescala. El desarrollo y la aplicación de métodos analíticos cuantitativos y de detección confiables son esenciales para la implementación de las reglas de etiquetado. Las estrategias y métodos de muestreo apropiados para la preparación de muestras, así como el desarrollo y la aplicación de métodos para detectar OMG y sus derivados, deben ir seguidos del establecimiento de criterios de validación y evaluación del rendimiento. Dado que las muestras de referencia son una parte indispensable de cualquier protocolo analítico, también se deben considerar los criterios para la fabricación de materiales de referencia estándar. Para generar confianza en los procedimientos de prueba y complementar los requisitos de aplicación, existe una necesidad urgente de utilizar métodos validados y reconocidos oficialmente a nivel internacional. Hasta la fecha, se han sometido a ensayos de validación varios métodos para diferentes matrices alimentarias. Aunque alentadores, los informes resultantes han presentado un análisis estadístico bastante limitado, lo que sugiere un enfoque más precautorio en su evaluación. De hecho, los métodos sometidos a pruebas interlaboratorios variaron significativamente en cuanto a su fiabilidad, solidez y reproducibilidad. Aunque a veces se hacían declaraciones de muy alta sensibilidad, a menudo no estaban respaldadas por análisis estadísticos apropiados y estudios de rendimiento detallados. Es necesario realizar más estudios de validación, especialmente sobre los métodos de PCR cuantitativos, para proporcionar nuevos métodos de extracción para matrices alimentarias y nuevas construcciones de OMG. Queda mucho trabajo por hacer, por lo tanto, en respuesta a las crecientes demandas de los consumidores y los responsables políticos para generar confianza en que los productos alimenticios en el mercado cumplen los requisitos de la legislación de la UE en rápida evolución.

The need to monitor and verify the presence and the amount of GMOs in agricultural crops and in products derived thereof has generated a demand for analytical methods capable of detecting, identifying and quantifying either the DNA introduced or the protein(s) expressed in transgenic plants, because these components are considered as the fundamental constituents. Several laboratories have developed therefore, methods either based on DNA detection using the polymerase chain reaction (PCR) technique, or on protein detection using enzyme linked immunosorbent assays (ELISA). Although much progress has been achieved in the development of genetic analysis methods, such as those based on the use of polymerase chain reaction (PCR), several other analytical technologies that can provide solutions to current technical issues in GMO analysis are emerging. Those includes, mass spectrometry, chromatography, near infrared spectroscopy, micro fabricated devices, DNA chip technology and nanoscale GMO analysis. The development and application of reliable detection and quantitative analytical methods is essentials for the implementation of labelling rules. Appropriate sampling strategies and methods for sample preparation, as well as methods development and application to detect GMOs and their derivatives must then be followed by the establishment of validation criteria and performance assessment. Since reference samples are an indispensable part of any analytical protocol, criteria for manufacturing standard reference materials must also be considered. In order to create confidence in the testing procedures and complement enforcement requirements, there is an urgent need for using methods that are validated and officially recognised at an international level. To date, several methods for different food matrices have been submitted to validation trials. Although encouraging, the resulting reports have presented rather limited statistical analysis, which suggests a more precautionary approach in their evaluation. Indeed, the methods subjected to ring trials varied significantly in their reliability, robustness and reproducibility. Even though claims of very high sensitivity were sometimes made, they were often not supported by appropriate statistical analysis and detailed performance studies. More validation studies, especially on the quantitative PCR methods, need to be performed to provide new extraction methods for food matrices and novel GMO constructs. Considerable work remain to be done, therefore, in response to the increasing demands of consumers and policy makers to give confidence that food products on the market meet the requirements of the rapidly evolving EU legislation.

Siete líneas de maíz modificado genéticamente (MG) han sido autorizadas en Japón como alimentos y piensos importados de EE.UU.. Mejoramos un método de PCR multiplex descrito en el informe anterior para distinguir las cinco líneas de maíz modificado genéticamente. El ADN genómico se extrajo del maíz modificado genéticamente con un kit de columna de sílice, lo que podría reducir el tiempo experimental y mejorar la seguridad en el laboratorio y, potencialmente, en el medio ambiente. Se secuenció el ADN recombinante (ADN-r) introducido en el maíz MG y se rediseñaron nuevos pares de cebadores para aumentar la especificidad de la PCR con el fin de distinguir cinco líneas de maíz MG mediante PCR multiplex. También se diseñó un par de cebadores para el gen intrínseco de la zeína del maíz (Ze1) con el fin de confirmar la presencia de ADN de maíz amplificable. Las longitudes de los productos de la PCR utilizando estos seis pares de cebadores eran diferentes. El Ze1 y el ADNr de las cinco líneas de maíz transgénico se detectaron cualitativamente en un tubo. Las bandas PCR específicas se distinguían entre sí en función de la longitud esperada. El ADNr pudo detectarse a partir de muestras de maíz que contenían un 0,5% de cada una de las cinco líneas de maíz MG. La sensibilidad sería aceptable para garantizar la verificación de los materiales no modificados genéticamente y controlar la fiabilidad del sistema de etiquetado.

Seven lines of genetically modified (GM) maize have been authorized in Japan as foods and feeds imported from the USA. We improved a multiplex PCR method described in the previous report in order to distinguish the five lines of GM maize. Genomic DNA was extracted from GM maize with a silica spin column kit, which could reduce experimental time and improve safety in the laboratory and potentially in the environment. We sequenced recombinant DNA (r-DNA) introduced into GM maize, and re-designed new primer pairs to increase the specificity of PCR to distinguish five lines of GM maize by multiplex PCR. A primer pair for the maize intrinsic zein gene (Ze1) was also designed to confirm the presence of amplifiable maize DNA. The lengths of PCR products using these six primer pairs were different. The Ze1 and the r-DNAs from the five lines of GM maize were qualitatively detected in one tube. The specific PCR bands were distinguishable from each other on the basis of the expected length. The r-DNA could be detected from maize samples containing 0.5% of each of the five lines of GM maize. The sensitivity would be acceptable to secure the verification of non-GMO materials and to monitor the reliability of the labeling system.

Se diseñó un método que utiliza la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la detección de maíz modificado genéticamente (maíz MG). Hay cuatro líneas de maíz MG importadas de Estados Unidos, y la presencia de ácido desoxirribonucleico (ADN) recombinante en el maíz pudo detectarse con cuatro pares de cebadores oligonucleotídicos específicos diseñados a partir de las secuencias de los genes recién introducidos. También se detectó el gen de la zeína del maíz como control interno. Este método permite la detección específica de cada uno de los genes Bt11, Event176, MON810 y LIBERTY mediante el uso de pares de cebadores específicos diseñados para amplificar un segmento que incluye parte de la secuencia introducida exógenamente y parte de la secuencia intrínseca del maíz. La sensibilidad de detección fue de aproximadamente 0,05% para Event176, MON810 y LIBERTY, y de aproximadamente 0,01% para Bt11. Para distinguir entre tres líneas de maíz transgénico resistentes a los insectos, diseñamos un método PCR multiplex. Estas tres líneas de maíz transgénico se distinguieron en función de las longitudes esperadas de sus amplicones.

A method using polymerase chain reaction (PCR) was designed for the detection of genetically modified maize (GM-maize). There are four lines of GM-maize imported from the United States, and the presence of recombinant deoxyribonucleic acid (DNA) in the maize could be detected with four pairs of specific oligonucleotide primers designed from the sequences of the newly introduced genes. The maize zein gene was also detected as an internal control. This method allows specific detection of each of Bt11, Event176, MON810 and LIBERTY by using pairs of specific primers designed to amplify a segment including part of the exogenously introduced sequence and part of the intrinsic maize sequence. The detection sensitivity was about 0.05% for Event176, MON810 and LIBERTY, and about 0.01% for Bt11. To distinguish among three insect-resistant GM-maize lines, we designed a multiplex PCR method. These three GM-maize lines were distinguishable on the basis of the expected lengths of their amplicons.

El uso de cultivos transgénicos ha generado preocupación por el desplazamiento de transgenes a huéspedes no deseados y las consecuencias ecológicas asociadas. Además, el control de la expresión de los transgenes en el campo es motivo de preocupación práctica (por ejemplo, la subexpresión de un gen de tolerancia a herbicidas en plantas de cultivo que van a ser rociadas con herbicida). Una solución a estos problemas potenciales es controlar la presencia y expresión de un gen de importancia agronómica vinculándolo a un gen marcador, como la GFP. Aquí mostramos que la fluorescencia de la GFP puede indicar la expresión del gen cry1Ac de Bacillus thuringiensus cuando se cointroduce en tabaco y colza, como demuestran los bioensayos con insectos y el análisis western blot. Además, realizamos dos temporadas de experimentos de campo para caracterizar el rendimiento de tres genes GFP diferentes en tabaco transgénico. El mejor gen probado fue mGFP5er, un gen GFP mutagenizado que se dirige al retículo endoplásmico. También demostramos que las plantas huésped que sintetizaban GFP en el campo no sufrían costes de fitness.

The use of transgenic crops has generated concerns about transgene movement to unintended hosts and the associated ecological consequences. Moreover, the in-field monitoring of transgene expression is of practical concern (e.g., the underexpression of an herbicide tolerance gene in crop plants that are due to be sprayed with herbicide). A solution to these potential problems is to monitor the presence and expression of an agronomically important gene by linking it to a marker gene, such as GFP. Here we show that GFP fluorescence can indicate expression of the Bacillus thuringiensus cry1Ac gene when co-introduced into tobacco and oilseed rape, as demonstrated by insect bioassays and western blot analysis. Furthermore we conducted two seasons of field experiments to characterize the performance of three different GFP genes in transgenic tobacco. The best gene tested was mGFP5er, a mutagenized GFP gene that is targeted to the endoplasmic reticulum. We also demonstrated that host plants synthesizing GFP in the field suffered no fitness costs.