Detección de organismos genéticamente modificados

Para mantener las regulaciones de OGM de la UE, los productores de nuevas variedades de cultivos GM deben proporcionar un método específico para eventos para la nueva variedad. Como resultado, los métodos están disponibles hoy en día para los organismos modificados genéticamente (OGM) autorizados por la UE, pero solo de forma limitada para los OGM no autorizados por la UE (NAG). En la última década, la diversidad de ingredientes genéticamente modificados (GM) en alimentos y piensos ha aumentado significativamente. Como resultado de este aumento, los laboratorios de OGM actualmente necesitan aplicar muchos métodos diferentes para establecer la presencia potencial de NAG en materias primas y productos derivados complejos. En este artículo presentamos un método innovador para detectar OGM (aprobados), así como la posible presencia de NAG en muestras de ADN complejas que contienen diferentes especies de cultivos. Se ha desarrollado un protocolo optimizado para la ligadura de la sonda candado en combinación con la detección de micromatrices (PPLMD) que se puede ampliar fácilmente. Se han desarrollado sondas de candado lineales dirigidas contra eventos, elementos y especies de OMG que pueden hibridarse con su ADN genómico diana y se visualizan mediante hibridación de micromatrices. En un experimento tenplex PPLMD, se detectaron diferentes objetivos genómicos en soja Roundup-Ready, algodón MON1445 y maíz Bt176 hasta al menos el 1 %. En experimentos individuales, los objetivos se detectaron hasta un 0,1 %, es decir, comparables a la qPCR estándar. En comparación con los métodos actualmente disponibles, este es un importante paso adelante hacia la detección múltiplex en materias primas complejas y productos derivados. Se muestra que el enfoque PPLMD es adecuado para la detección a gran escala de OMG en muestras de la vida real y brinda la posibilidad de detectar y/o identificar NAG que de otro modo permanecerían sin detectar.

To maintain EU GMO regulations, producers of new GM crop varieties need to supply an event-specific method for the new variety. As a result methods are nowadays available for EU-authorised genetically modified organisms (GMOs), but only to a limited extent for EU-non-authorised GMOs (NAGs). In the last decade the diversity of genetically modified (GM) ingredients in food and feed has increased significantly. As a result of this increase GMO laboratories currently need to apply many different methods to establish to potential presence of NAGs in raw materials and complex derived products. In this paper we present an innovative method for detecting (approved) GMOs as well as the potential presence of NAGs in complex DNA samples containing different crop species. An optimised protocol has been developed for padlock probe ligation in combination with microarray detection (PPLMD) that can easily be scaled up. Linear padlock probes targeted against GMO-events, -elements and -species have been developed that can hybridise to their genomic target DNA and are visualised using microarray hybridisation. In a tenplex PPLMD experiment, different genomic targets in Roundup-Ready soya, MON1445 cotton and Bt176 maize were detected down to at least 1%. In single experiments, the targets were detected down to 0.1%, i.e. comparable to standard qPCR. Compared to currently available methods this is a significant step forward towards multiplex detection in complex raw materials and derived products. It is shown that the PPLMD approach is suitable for large-scale detection of GMOs in real-life samples and provides the possibility to detect and/or identify NAGs that would otherwise remain undetected.

La validación es el proceso que establece la idoneidad de un método analítico para un propósito particular. Se han desarrollado varias pautas que definen los procedimientos estadísticos para la validación de métodos químicos, bioquímicos, farmacéuticos y moleculares, y las métricas de validación ad hoc (índices y estadísticas de prueba) están disponibles y se usan de forma rutinaria, para pruebas internas y entre laboratorios y toma de decisiones. Sin embargo, no existe una práctica universalmente aceptada para la validación de ensayos y, a menudo, la subjetividad juega un papel importante en la interpretación de los resultados de los estudios de validación. En cambio, la clave para los estudios de validación racional se basa en la formalización y armonización de los procedimientos para su diseño e interpretación de los resultados. Las técnicas de base difusa pueden ser útiles a este respecto. La lógica difusa permite resumir la información obtenida por las estadísticas de validación independientes clásicas en un índice sintético del rendimiento general del método. La posibilidad de tener un indicador completo del rendimiento del método tiene la ventaja de permitir la comparación directa de métodos, lo que facilita la evaluación de muchas métricas individuales, posiblemente contradictorias. Los objetivos de este artículo son ilustrar las ventajas que un método de agregación de base difusa podría aportar a la validación de métodos analíticos y proponer su aplicación para la evaluación del rendimiento de los métodos. Las métricas de validación se comparan para ejemplos prácticos de evaluación del rendimiento del método en estudios colaborativos. Se demuestra que las reglas basadas en lógica difusa son aplicables para mejorar la comprensión de la calidad del método y la interpretación de los resultados.

Validation is the process establishing the suitability of an analytical method for a particular purpose. Various guidelines defining statistical procedures for validation of chemical, bio-chemical, pharmaceutical, and molecular methods have been developed, and ad hoc validation metrics (indices and test statistics) are available and routinely used, for in-house and interlaboratory testing and decision making. However, there is no universally accepted practice for assay validation, and often, subjectivity plays an important role in the interpretation of validation studies’ results. Instead, the key to rational validation studies relies upon the formalization and harmonization of procedures for their design and interpretation of results. Fuzzy-based techniques can be helpful in such respect. Fuzzy logic allows summarizing the information obtained by classic independent validation statistics into one synthetic index of overall method performance. The possibility of having a comprehensive indicator of method performance has the advantage of permitting direct method comparison, facilitating the evaluation of many individual, possibly contradictory metrics. The objectives of this paper are to illustrate the advantages that a fuzzy-based aggregation method could bring into the validation of analytical methods and to propose its application for the evaluation of methods’ performance. Validation metrics are compared for practical examples of assessment of method performance in collaborative studies. Fuzzy logic-based rules are shown to be applicable to improve insights into method quality and interpretation of results.

Con el desarrollo de las técnicas de detección de organismos modificados genéticamente (OMG), la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ha sido el pilar para la detección de OMG, y la PCR en tiempo real es el método más eficaz e importante para la cuantificación de OMG. Se está desarrollando una estrategia de detección de eventos específicos basada en las secuencias de unión de integración únicas y específicas entre el ADN del genoma de la planta huésped y el gen integrado por su alta especificidad. Este estudio establece los métodos de detección de eventos específicos para los maíces TC1507 y CBH351. Además, se optimizaron y desarrollaron sistemáticamente los métodos de detección TaqMan PCR en tiempo real específicos para otros siete eventos de maíz transgénico (Bt11, Bt176, GA21, MON810, MON863, NK603 y T25). En estos ensayos PCR, el quencher fluorescente, TAMRA, se tiñó en la base T de la sonda en la posición interna para mejorar la intensidad de la señal fluorescente. Para superar las dificultades en la obtención de los materiales de referencia certificados de estos maíces GM, se construyó una nueva molécula de referencia estándar que contenía las nueve secuencias de unión de integración específicas de estos maíces GM y el gen de referencia endógeno del maíz, zSSIIb, y se utilizó para el análisis cuantitativo. Los límites de detección de estos métodos fueron de 20 copias para estos diferentes maíces GM, los límites de cuantificación fueron de aproximadamente 20 copias, y los rangos dinámicos para la cuantificación fueron de 0,05 a 100% en 100 ng de plantilla de ADN. Además, se analizaron cuantitativamente nueve grupos de muestras de maíz mezclado de estos nueve eventos de maíz MG para evaluar la exactitud y la precisión. La exactitud expresada como sesgo varió del 0,67 al 28,00% para los nueve grupos de muestras de maíz MG analizados, y la precisión expresada como desviaciones estándar relativas fue del 0,83 al 26,20%. Todo ello indicaba que los sistemas de detección PCR en tiempo real específicos de evento establecidos y la molécula de referencia de este estudio son adecuados para la identificación y cuantificación de estos maíces MG.

With the development of genetically modified organism (GMO) detection techniques, the Polymerase Chain Reaction (PCR) technique has been the mainstay for GMO detection, and real-time PCR is the most effective and important method for GMO quantification. An event-specific detection strategy based on the unique and specific integration junction sequences between the host plant genome DNA and the integrated gene is being developed for its high specificity. This study establishes the event-specific detection methods for TC1507 and CBH351 maizes. In addition, the event-specific TaqMan real-time PCR detection methods for another seven GM maize events (Bt11, Bt176, GA21, MON810, MON863, NK603, and T25) were systematically optimized and developed. In these PCR assays, the fluorescent quencher, TAMRA, was dyed on the T-base of the probe at the internal position to improve the intensity of the fluorescent signal. To overcome the difficulties in obtaining the certified reference materials of these GM maizes, one novel standard reference molecule containing all nine specific integration junction sequences of these GM maizes and the maize endogenous reference gene, zSSIIb, was constructed and used for quantitative analysis. The limits of detection of these methods were 20 copies for these different GM maizes, the limits of quantitation were about 20 copies, and the dynamic ranges for quantification were from 0.05 to 100% in 100 ng of DNA template. Furthermore, nine groups of the mixed maize samples of these nine GM maize events were quantitatively analyzed to evaluate the accuracy and precision. The accuracy expressed as bias varied from 0.67 to 28.00% for the nine tested groups of GM maize samples, and the precision expressed as relative standard deviations was from 0.83 to 26.20%. All of these indicated that the established event-specific real-time PCR detection systems and the reference molecule in this study are suitable for the identification and quantification of these GM maizes.

El maíz es uno de los principales cultivos en todo el mundo y en muchos países se cultiva y comercializa un número cada vez mayor de variedades de maíz modificado genéticamente (MG) en paralelo a los cultivos convencionales. Dadas las normas de etiquetado establecidas, por ejemplo, en la Unión Europea y la necesaria coexistencia entre cultivos transgénicos y no transgénicos, es importante determinar el grado de diseminación del polen del maíz transgénico a otros cultivares en condiciones de campo. Los métodos más utilizados para la detección cuantitativa de OMG se basan en la PCR en tiempo real, lo que implica que los resultados se expresan en porcentajes de genoma (en contraste con los porcentajes de semilla o grano). Nuestro objetivo era evaluar la precisión de los ensayos basados en PCR en tiempo real para cuantificar con exactitud el contenido de granos transgénicos en campos no modificados genéticamente en comparación con la tasa real de fecundación cruzada determinada mediante análisis fenotípicos. Realizamos este estudio en una región en la que normalmente se cultivan tanto maíz transgénico como convencional y utilizamos el maíz transgénico predominante Mon810 en combinación con una variedad de maíz convencional que presenta la característica de granos blancos (por lo que permite la cuantificación de la polinización cruzada como porcentaje de granos amarillos). Nuestros resultados indicaron una excelente correlación entre los resultados de la PCR en tiempo real y el número de granos de polinización cruzada a niveles de Mon810 del 0,1-10%. En cambio, el porcentaje de Mon810 estimado por el peso de los granos produjo resultados menos precisos. Por último, presentamos y discutimos el patrón de flujo genético mediado por el polen del maíz transgénico al convencional en un caso de ejemplo en condiciones de campo.

Maize is one of the main crops worldwide and an increasing number of genetically modified (GM) maize varieties are cultivated and commercialized in many countries in parallel to conventional crops. Given the labeling rules established e.g. in the European Union and the necessary coexistence between GM and non-GM crops, it is important to determine the extent of pollen dissemination from transgenic maize to other cultivars under field conditions. The most widely used methods for quantitative detection of GMO are based on real-time PCR, which implies the results are expressed in genome percentages (in contrast to seed or grain percentages). Our objective was to assess the accuracy of real-time PCR based assays to accurately quantify the contents of transgenic grains in non-GM fields in comparison with the real cross-fertilization rate as determined by phenotypical analysis. We performed this study in a region where both GM and conventional maize are normally cultivated and used the predominant transgenic maize Mon810 in combination with a conventional maize variety which displays the characteristic of white grains (therefore allowing cross-pollination quantification as percentage of yellow grains). Our results indicated an excellent correlation between real-time PCR results and number of cross-fertilized grains at Mon810 levels of 0.1–10%. In contrast, Mon810 percentage estimated by weight of grains produced less accurate results. Finally, we present and discuss the pattern of pollen-mediated gene flow from GM to conventional maize in an example case under field conditions.

Varios países han establecido normativas que estipulan el etiquetado de productos agrícolas, piensos y alimentos que contengan o estén elaborados a partir de material modificado genéticamente (MG) o que contengan material MG adventicio en cantidades que superen determinados umbrales. Aunque las normativas de algunos países hacen referencia al material modificado genéticamente en porcentaje peso por peso (p/p), los métodos de detección aplicados actualmente no miden directamente el porcentaje p/p del material modificado genéticamente. Dependiendo del método concreto y de la matriz de la muestra a la que se aplique, la conversión de los resultados analíticos a un porcentaje p/p es difícil o imposible. Se ha desarrollado el primer sistema rápido de PCR para la detección de maíz modificado genéticamente en un solo grano. El equipo para la molienda de granos individuales y un kit de extracción de ADN de 96 pocillos basado en una membrana de sílice se revisaron y optimizaron de forma significativa para este fin concreto, respectivamente. Hemos desarrollado un método de PCR multiplex en tiempo real para la cuantificación rápida de secuencias de ADN modificado genéticamente en las soluciones de ADN obtenidas. Además, un método de detección PCR cualitativa multiplex permite la detección simultánea de diferentes rasgos de maíz MG en cada grano y, por tanto, la identificación de granos individuales que contienen una combinación de dos o más rasgos MG. Los métodos propuestos pueden proporcionar resultados informativos de forma rápida, precisa y fiable, especialmente en el caso de muestras de grano que puedan contener granos de maíz modificado genéticamente con rasgos combinados.

Various countries have established regulations that stipulate the labeling of agricultural commodities, feed, and food products that contain or are made from genetically modified (GM) material or that contain adventitious GM material in amounts that exceed certain threshold levels. While regulations in some countries refer to GM material on a weight per weight (w/w) percentage, the currently applied detection methods do not directly measure the w/w percentage of the GM material. Depending on the particular method and the sample matrix it is applied to, the conversion of analytical results to a w/w percentage is challenging or not possible. The first rapid PCR system for GM maize detection on a single kernel basis has been developed. The equipment for the grinding of individual kernels and a silica membrane-based 96-well DNA extraction kit were both significantly revised and optimized for this particular purpose, respectively. We developed a multiplex real-time PCR method for the rapid quantification of GM DNA sequences in the obtained DNA solutions. In addition, a multiplex qualitative PCR detection method allows for the simultaneous detection of different GM maize traits in each kernel and thereby for identification of individual kernels that contain a combination of two or more GM traits. Especially for grain samples that potentially contain combined-trait GM maize kernels, the proposed methods can deliver informative results in a rapid, precise, and reliable manner.

Debido a las políticas de etiquetado de organismos modificados genéticamente (OMG) emitidas en muchos países y zonas, se desarrollaron métodos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la ejecución de las políticas de etiquetado de OMG, como los métodos de detección por PCR de cribado, específicos de genes, específicos de construcción y específicos de eventos, que se han convertido en un pilar de la detección de OMG. El método de detección PCR específico de evento es la tendencia principal en la detección de OGMs debido a su alta especificidad basada en la secuencia flanqueante del integrante exógeno. Este maíz modificado genéticamente, MON863, contiene una secuencia codificante Cry3Bb1 que produce una proteína con mayor actividad insecticida contra el gusano de la raíz del maíz, una plaga de coleópteros. En este estudio, la secuencia de unión 5'-integración entre el ADN de la planta huésped y la construcción genética integrada del maíz modificado genéticamente MON863 se reveló mediante PCR entrelazada asimétrica térmica, y los cebadores PCR específicos y la sonda TaqMan se diseñaron basándose en la secuencia de unión 5'-integración revelada; se desarrollaron con éxito los métodos de detección cualitativa convencional por PCR y cuantitativa por PCR TaqMan en tiempo real empleando estos cebadores y sondas. En el ensayo de PCR cualitativa convencional, el límite de detección (LOD) fue del 0,1% para MON863 en 100 ng de ADN genómico de maíz para una reacción. En el ensayo cuantitativo de PCR TaqMan en tiempo real, el LOD y el límite de cuantificación fueron de ocho y 80 copias del genoma haploide, respectivamente. Además, se detectaron tres muestras mixtas de maíz con contenidos conocidos de MON863 utilizando los sistemas de PCR en tiempo real establecidos, y los resultados ideales indicaron que los sistemas de detección de PCR en tiempo real específicos del evento establecidos eran fiables, sensibles y precisos.

Because of the genetically modified organisms (GMOs) labeling policies issued in many countries and areas, polymerase chain reaction (PCR) methods were developed for the execution of GMO labeling policies, such as screening, gene specific, construct specific, and event specific PCR detection methods, which have become a mainstay of GMOs detection. The event specific PCR detection method is the primary trend in GMOs detection because of its high specificity based on the flanking sequence of the exogenous integrant. This genetically modified maize, MON863, contains a Cry3Bb1 coding sequence that produces a protein with enhanced insecticidal activity against the coleopteran pest, corn rootworm. In this study, the 5‘-integration junction sequence between the host plant DNA and the integrated gene construct of the genetically modified maize MON863 was revealed by means of thermal asymmetric interlaced-PCR, and the specific PCR primers and TaqMan probe were designed based upon the revealed 5‘-integration junction sequence; the conventional qualitative PCR and quantitative TaqMan real-time PCR detection methods employing these primers and probes were successfully developed. In conventional qualitative PCR assay, the limit of detection (LOD) was 0.1% for MON863 in 100 ng of maize genomic DNA for one reaction. In the quantitative TaqMan real-time PCR assay, the LOD and the limit of quantification were eight and 80 haploid genome copies, respectively. In addition, three mixed maize samples with known MON863 contents were detected using the established real-time PCR systems, and the ideal results indicated that the established event specific real-time PCR detection systems were reliable, sensitive, and accurate.

Se utilizó un protocolo optimizado de extracción de ADN de tejidos animales, junto con métodos sensibles de PCR, para determinar si se pueden detectar trazas de fragmentos de ADN de origen vegetal y/o transgénico derivados de piensos en muestras de tejidos animales, como leche de vaca y muestras de músculo (carne) de pollos, cerdos y bueyes. Se desarrollaron ensayos para detectar fragmentos de ADN tanto del gen de la rubisco del maíz codificado en el cloroplasto (rbcL) con un elevado número de copias como de elementos transgénicos codificados en el núcleo con una sola copia (p35S y un fragmento de gen específico de MON 810). Las especificidades de los dos ensayos PCR para rbcL y de los dos ensayos PCR para ADN transgénico se establecieron mediante pruebas con una serie de especies de plantas convencionales y cultivos de maíz modificado genéticamente. Las sensibilidades de los dos ensayos PCR rbcL (que dan lugar a amplicones de 173 y 500 pb) fueron similares, detectando tan sólo 0,08 y 0,02 equivalentes genómicos, respectivamente. Las sensibilidades de los ensayos PCR p35S y MON 810 fueron de aproximadamente 5 y 10 equivalentes genómicos para amplicones de 123 pb y 149 pb, respectivamente, que fueron considerablemente menores que la sensibilidad de los ensayos rbcL en términos de equivalentes de células vegetales, pero aproximadamente similares cuando se tiene en cuenta el mayor número de copias del genoma del cloroplasto por célula. El ensayo rbcL de 173 pb detectó el fragmento de ADN del cloroplasto de la planta diana en el 5%, 15% y 53% de las muestras de músculo de bueyes de carne, pollos de engorde y cerdos, respectivamente, y en el 86% de las muestras de leche de vacas lecheras. El nuevo análisis de nuevas alícuotas de 31 de las muestras de carne de cerdo que resultaron positivas en la PCR rbcL de 173 pb mostró que el 58% de estas muestras eran positivas de forma reproducible en este mismo ensayo de PCR. El ensayo rbcL de 500 pb detectó fragmentos de ADN en el 43% de las muestras de músculo porcino y en el 79% de las muestras de leche. En comparación, no se produjeron detecciones estadísticamente significativas de fragmentos de ADN transgénico mediante el ensayo PCR p35S en ninguna de estas muestras de tejido animal.

An optimized DNA extraction protocol for animal tissues coupled with sensitive PCR methods was used to determine whether trace levels of feed-derived DNA fragments, plant and/or transgenic, are detectable in animal tissue samples including dairy milk and samples of muscle (meat) from chickens, swine, and beef steers. Assays were developed to detect DNA fragments of both the high copy number chloroplast-encoded maize rubisco gene (rbcL) and single copy nuclear-encoded transgenic elements (p35S and a MON 810-specific gene fragment). The specificities of the two rbcL PCR assays and two transgenic DNA PCR assays were established by testing against a range of conventional plant species and genetically modified maize crops. The sensitivities of the two rbcL PCR assays (resulting in 173 and 500 bp amplicons) were similar, detecting as little as 0.08 and 0.02 genomic equivalents, respectively. The sensitivities of the p35S and MON 810 PCR assays were approximately 5 and 10 genomic equivalents for 123 bp and 149 bp amplicons, respectively, which were considerably less than the sensitivity of the rbcL assays in terms of plant cell equivalents, but approximately similar when the higher numbers of copies of the chloroplast genome per cell are taken into account. The 173 bp rbcL assay detected the target plant chloroplast DNA fragment in 5%, 15%, and 53% of the muscle samples from beef steers, broiler chickens, and swine, respectively, and in 86% of the milk samples from dairy cows. Reanalysis of new aliquots of 31 of the pork samples that were positive in the 173 bp rbcL PCR showed that 58% of these samples were reproducibly positive in this same PCR assay. The 500 bp rbcL assay detected DNA fragments in 43% of the swine muscle samples and 79% of the milk samples. By comparison, no statistically significant detections of transgenic DNA fragments by the p35S PCR assay occurred with any of these animal tissue samples.

La línea GA21 de maíz ha integrado varias copias repetidas en tándem del constructo r-act 5-enol-piruvilsiquimato-3-fosfato sintasa utilizado para la transformación de plantas. Hemos podido amplificar una secuencia de nucleótidos correspondiente al vector plasmídico polilinker flanqueado por el promotor r-act y el terminador 3′ de la nopalina sintasa. Se describe un método para la detección y cuantificación específica del ADN de la línea de maíz transgénico Roundup Ready® GA21 mediante PCR convencional y en tiempo real y basado en esta secuencia transgénica. Se diseñaron cebadores y sonda específicos para GA21 dirigidos a la región de unión vector-promotor y que amplifican un fragmento de ADN de 72 pb. Los métodos de cuantificación se optimizaron mediante tres químicas diferentes de PCR en tiempo real, es decir, SYBR® Green I, Amplifluor™ y TaqMan®. Los tres métodos demostraron ser específicos, altamente sensibles y fiables tanto para la identificación como para la cuantificación del ADN GA21. Se construyó un plásmido pGAivr que contenía copias únicas de los amplicones GA21 e invertasa para su uso como patrón externo en las curvas de calibración. Utilizando pGAivr, se optimizó un ensayo de PCR en tiempo real basado en TaqMan® en formato dúplex dirigido al gen ivr1 específico de la especie del maíz y a la región de unión GA21. El límite de detección del método fue del 0,01% de GA21, muy por debajo del umbral establecido para la presencia accidental de organismos modificados genéticamente (OMG), por lo que este método es adecuado para su uso en análisis rutinarios de OMG.

Maize GA21 line has integrated several tandemly repeated copies of the r-act 5-enol-pyruvylshikimate-3-phosphate synthase construct used for plant transformation. We were able to amplify a nucleotide sequence corresponding to the polylinker plasmid vector flanked by the r-act promoter and nopaline synthase 3′-terminator. A method for specific detection and quantification of Roundup Ready® transgenic maize line GA21 DNA using conventional and real-time PCR and based on this transgenic sequence is described. GA21 specific primers and probe were designed targeting the vector–promoter junction region and amplifying a 72 bp DNA fragment. Quantification methods were optimized through three different real-time PCR chemistries, i.e. SYBR® Green I, Amplifluor™ and TaqMan®. All three methods proved to be specific, highly sensitive and reliable for both identification and quantification of GA21 DNA. Plasmid pGAivr containing single copies of the GA21 and invertase amplicons was constructed for use as external standard in calibration curves. Using pGAivr, a TaqMan® based real-time PCR assay was optimized in duplex format targeting the maize species-specific ivr1 gene and the GA21 junction region. Thedetection limit of the method was 0.01% GA21, which is far below the established threshold for accidental presence of genetically modified organisms (GMO), this method therefore being suitable for use in routine GMO analysis.

La creciente presencia de derivados vegetales transgénicos en una amplia gama de productos de consumo animal y humano ha provocado en Europa occidental una fuerte demanda de métodos de detección adecuados para evaluar la existencia de elementos transgénicos. Entre las diferentes técnicas utilizadas actualmente, la PCR cuantitativa en tiempo real es una potente tecnología bien adaptada a los requisitos obligatorios de etiquetado en la Unión Europea (UE). Recientemente se ha sugerido el uso de secuencias genómicas de flanqueo de transgenes como medio para evitar resultados ambiguos tanto en tecnologías cualitativas como cuantitativas basadas en PCR. En este estudio reportamos la identificación de secuencias genómicas adyacentes al sitio de integración 3′ del evento MON810 en maíz transgénico. Este cultivo modificado genéticamente contiene secuencias transgénicas que conducen a la expresión ectópica de una endotoxina sintética CryIA(b) que confiere resistencia a insectos lepidópteros, especialmente contra el barrenador europeo del maíz. La caracterización de las secuencias de unión genoma-transgén mediante TAIL-PCR ha facilitado el diseño de un método de cuantificación específico, sensible y preciso basado en la química TaqMan. La clonación de la región de unión 3′ del evento MON810 también ha permitido comparar la idoneidad de las secuencias diana plasmídicas frente al ADN genómico obtenido a partir de materiales de referencia certificados (MRC), con el fin de preparar curvas de calibración estándar para la cuantificación.

The increasing presence of transgenic plant derivatives in a wide range of animal and human consumables has provoked in western Europe a strong demand for appropriate detection methods to evaluate the existence of transgenic elements. Among the different techniques currently used, the real-time quantitative PCR is a powerful technology well adapted to the mandatory labeling requirements in the European Union (EU). The use of transgene flanking genomic sequences has recently been suggested as a means to avoid ambiguous results both in qualitative and quantitative PCR-based technologies. In this study we report the identification of genomic sequences adjacent to the 3′-integration site of event MON810 in transgenic maize. This genetically modified crop contains transgene sequences leading to ectopic expression of a synthetic CryIA(b) endotoxin which confers resistance to lepidopteran insects especially against the European corn borer. The characterization of the genome–transgene junction sequences by means of TAIL-PCR has facilitated the design of a specific, sensitive and accurate quantification method based on TaqMan chemistry. Cloning of event MON810 3′-junction region has also allowed to compare the suitability of plasmid target sequences versus genomic DNA obtained from certified reference materials (CRMs), to prepare standard calibration curves for quantification.

Se desarrollaron procedimientos de PCR multiplex para detectar simultáneamente múltiples secuencias diana en soja genéticamente modificada (GM) (Roundup Ready), maíz (evento 176, Bt11, Mon810, T14/25) y canola (GT73, HCN92/28, MS8/RF3, Oxy 235). Se incluyeron objetivos de control interno (gen de la invertasa en el maíz, genes de la lectina y de la β-actina en la soja, y gen de la cruciferina en la colza) según convenía para evaluar la eficacia de todas las reacciones, eliminando así cualquier falso negativo. Se utilizaron combinaciones de cebadores que permitieron la identificación de líneas específicas. En un sistema de identificación, se utilizó el perfil de amplificación simultánea (SAP), en lugar de la detección de dianas específicas, para la identificación de cuatro líneas de maíz MG. El SAP es sencillo y tiene el potencial de identificar tanto líneas transgénicas aprobadas como no aprobadas. La concentración de la plantilla se identificó como un factor crítico que afecta a la eficacia de las PCR multiplex. En canola, 75 ng de ADN molde fueron más eficaces que 50 ng de ADN para la amplificación simultánea de todos los objetivos en un volumen de reacción de 25 μL. Se logró una identificación fiable de la canola modificada genéticamente a una concentración de ADN de 3 ng/μL, y al 0,1% para la soja modificada genéticamente, lo que indica altos niveles de sensibilidad. En este estudio se utilizó la amplificación inespecífica como herramienta para la identificación específica y fiable de una línea de maíz transgénico. El cebador cry1A 4-3' (cebador antisentido) reconoce dos sitios en la plantilla de ADN extraída del maíz transgénico que contiene el evento 176 (resistente al barrenador europeo del maíz), dando lugar a la amplificación de productos de 152 pb (esperado) y 485 pb (inesperado). Este último fragmento se secuenció y se confirmó que era específico de Cry1A. Los sistemas aquí descritos representan métodos de detección de OMG sencillos, precisos y sensibles en los que sólo es necesaria una reacción para detectar múltiples secuencias diana de OMG que pueden utilizarse de forma fiable para la identificación de líneas específicas de OMG.

Multiplex PCR procedures were developed for simultaneously detecting multiple target sequences in genetically modified (GM) soybean (Roundup Ready), maize (event 176, Bt11, Mon810, T14/25), and canola (GT73, HCN92/28, MS8/RF3, Oxy 235). Internal control targets (invertase gene in corn, lectin and β-actin genes in soybean, and cruciferin gene in canola) were included as appropriate to assess the efficiency of all reactions, thereby eliminating any false negatives. Primer combinations that allowed the identification of specific lines were used. In one system of identification, simultaneous amplification profiling (SAP), rather than target specific detection, was used for the identification of four GM maize lines. SAP is simple and has the potential to identify both approved and nonapproved GM lines. The template concentration was identified as a critical factor affecting efficient multiplex PCRs. In canola, 75 ng of DNA template was more effective than 50 ng of DNA for the simultaneous amplification of all targets in a reaction volume of 25 μL. Reliable identification of GM canola was achieved at a DNA concentration of 3 ng/μL, and at 0.1% for GM soybean, indicating high levels of sensitivity. Nonspecific amplification was utilized in this study as a tool for specific and reliable identification of one line of GM maize. The primer cry1A 4-3‘ (antisense primer) recognizes two sites on the DNA template extracted from GM transgenic maize containing event 176 (European corn borer resistant), resulting in the amplification of products of 152 bp (expected) and 485 bp (unexpected). The latter fragment was sequenced and confirmed to be Cry1A specific. The systems described herein represent simple, accurate, and sensitive GMO detection methods in which only one reaction is necessary to detect multiple GM target sequences that can be reliably used for the identification of specific lines of GMOs.