Detección de organismos genéticamente modificados

El método más común de detección de OGM se basa en la amplificación de amplicones de ADN específicos de OGM mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Aquí hemos aplicado el método de amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) para amplificar secuencias de ADN relacionadas con OGM, motivos "internos" de uso común para controlar la expresión transgénica y uniones específicas de eventos (planta-transgén). Hemos probado la especificidad y la sensibilidad de la técnica para su uso en estudios de OGM. Los resultados muestran que fue posible la detección de OGM al 0,01 % en el ADN de fondo equivalente y las diluciones de la plantilla sugieren que la detección a partir de copias únicas de la plantilla puede ser posible utilizando LAMP. Este trabajo muestra que la detección de OGM se puede llevar a cabo utilizando LAMP para la detección de rutina, así como para la detección de eventos específicos. Además, la sensibilidad y la capacidad para amplificar objetivos, incluso con un fondo alto de ADN, aquí demostrada, destaca las ventajas de esta amplificación isotérmica cuando se aplica para la detección de OGM.

The most common method of GMO detection is based upon the amplification of GMO-specific DNA amplicons using the polymerase chain reaction (PCR). Here we have applied the loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method to amplify GMO-related DNA sequences, 'internal' commonly-used motifs for controlling transgene expression and event-specific (plant-transgene) junctions. We have tested the specificity and sensitivity of the technique for use in GMO studies. Results show that detection of 0.01% GMO in equivalent background DNA was possible and dilutions of template suggest that detection from single copies of the template may be possible using LAMP. This work shows that GMO detection can be carried out using LAMP for routine screening as well as for specific events detection. Moreover, the sensitivity and ability to amplify targets, even with a high background of DNA, here demonstrated, highlights the advantages of this isothermal amplification when applied for GMO detection.

La detección de materiales genéticamente modificados (GM) en alimentos y forrajes es un proceso analítico complejo de varios pasos que invoca el cribado, la identificación y, a menudo, la cuantificación de los organismos genéticamente modificados (OGM) presentes en una muestra. El "cribado combinado qPCR SYBRGreen" (CoSYPS) es un enfoque basado en una matriz para determinar la presencia de materiales vegetales modificados genéticamente en los productos. El sistema de soporte de decisiones (DSS) de CoSYPS interpreta los resultados analíticos del análisis de qPCR de SYBRGREEN en función de cuatro valores: los valores C(t)- y T(m) y el LOD y LOQ para cada método. Se proporciona una explicación teórica de los diferentes conceptos aplicados en el análisis CoSYPS (Universo GMO, "Rastreo de números primos", enfoque matricial/combinatorio) y se documenta utilizando el RoundUp Ready soy GTS40-3-2 como ejemplo. Mediante la aplicación de un conjunto limitado de métodos SYBRGREEN qPCR y mediante la aplicación de un algoritmo basado en "números primos" recientemente desarrollado, se puede determinar la naturaleza de los subconjuntos de OGM correspondientes en una muestra. Juntos, estos análisis brindan orientación para la estimación semicuantitativa de la presencia de OGM en un alimento y forraje.

The detection of genetically modified (GM) materials in food and feed products is a complex multi-step analytical process invoking screening, identification, and often quantification of the genetically modified organisms (GMO) present in a sample. "Combinatory qPCR SYBRGreen screening" (CoSYPS) is a matrix-based approach for determining the presence of GM plant materials in products. The CoSYPS decision-support system (DSS) interprets the analytical results of SYBRGREEN qPCR analysis based on four values: the C(t)- and T(m) values and the LOD and LOQ for each method. A theoretical explanation of the different concepts applied in CoSYPS analysis is given (GMO Universe, "Prime number tracing", matrix/combinatory approach) and documented using the RoundUp Ready soy GTS40-3-2 as an example. By applying a limited set of SYBRGREEN qPCR methods and through application of a newly developed "prime number"-based algorithm, the nature of subsets of corresponding GMO in a sample can be determined. Together, these analyses provide guidance for semi-quantitative estimation of GMO presence in a food and feed product.

La industria de la biotecnología agrícola utiliza rutinariamente la PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR) para la detección de rasgos derivados de la biotecnología en el material vegetal, particularmente para cumplir con los requisitos de los mandatos legislativos que se basan en la detección de trazas de ADN. La cuantificación a través de RT-qPCR en tiempo real en especies de plantas implica la medición del número de copias de un gen de control endógeno específico de taxón expuesto a las mismas manipulaciones que el gen objetivo antes de la amplificación. La Organización Internacional para la Estandarización (ISO 21570:2005) especifica que el número de copias de un gen de referencia endógeno se use para normalizar la concentración (expresada como % p/p) de un gen objetivo específico del rasgo cuando se usa RT-qPCR. Para este propósito, el número de copias de un gen de referencia endógeno expresado de forma constitutiva en la misma muestra se controla de forma rutinaria. Se empleó qPCR en tiempo real para evaluar la previsibilidad y el rendimiento de los genes de control endógenos comúnmente utilizados (almidón sintasa, SSIIb-2, SSIIb-3; alcohol deshidrogenasa, ADH; grupo de alta movilidad, HMG; zeína e invertasa, IVR) utilizados para detectar rasgos derivados de la biotecnología en el maíz. Los datos revelaron eficiencias de amplificación relativamente exactas y precisas cuando se comparó maíz isogénico con estándares de referencia certificados, pero resultados altamente variables cuando se compararon 23 cultivares de maíz no isogénico con un estándar de referencia IRMM Bt-11. Identificar el gen de control endógeno más adecuado, uno que se amplifique de manera consistente y predecible en diferentes cultivares de maíz, e implementarlo como un estándar reconocido internacionalmente contribuiría a la prueba armonizada de rasgos derivados de la biotecnología en el maíz.

The agricultural biotechnology industry routinely utilizes real-time quantitative PCR (RT-qPCR) for the detection of biotechnology-derived traits in plant material, particularly for meeting the requirements of legislative mandates that rely upon the trace detection of DNA. Quantification via real-time RT-qPCR in plant species involves the measurement of the copy number of a taxon-specific, endogenous control gene exposed to the same manipulations as the target gene prior to amplification. The International Organization for Standardization (ISO 21570:2005) specifies that the copy number of an endogenous reference gene be used for normalizing the concentration (expressed as a % w/w) of a trait-specific target gene when using RT-qPCR. For this purpose, the copy number of a constitutively expressed endogenous reference gene in the same sample is routinely monitored. Real-time qPCR was employed to evaluate the predictability and performance of commonly used endogenous control genes (starch synthase, SSIIb-2, SSIIb-3; alcohol dehydrogenase, ADH; high-mobility group, HMG; zein; and invertase, IVR) used to detect biotechnology-derived traits in maize. The data revealed relatively accurate and precise amplification efficiencies when isogenic maize was compared to certified reference standards, but highly variable results when 23 nonisogenic maize cultivars were compared to an IRMM Bt-11 reference standard. Identifying the most suitable endogenous control gene, one that amplifies consistently and predictably across different maize cultivars, and implementing this as an internationally recognized standard would contribute toward harmonized testing of biotechnology-derived traits in maize.

Para mejorar la eficacia de la validación interna de los métodos de detección de OMG (aislamiento de ADN y PCR en tiempo real, reacción en cadena de la polimerasa), se realizó un estudio para conocer mejor la contribución de los diferentes pasos del método de detección de OMG a la repetibilidad y reproducibilidad interna. En el presente estudio, se validaron internamente 19 métodos para soja (GM), canola de maíz y papa, de los cuales 14 se basaron en un esquema de validación de 8 días utilizando ocho muestras diferentes y cinco en base a un protocolo de validación más conciso. De esta forma se obtuvieron datos con respecto al límite de detección, exactitud y precisión. Asimismo, se calcularon los límites de decisión para declarar la no conformidad (>0,9%) con un 95% de confiabilidad. Para estimar la contribución de los diferentes pasos en el análisis de OGM a la variación total, los componentes de la varianza se estimaron utilizando REML (método de máxima verosimilitud residual). A partir de estos componentes, se calcularon las desviaciones estándar relativas de repetibilidad y reproducibilidad (RSDr y RSDR). Los resultados mostraron que no solo la reacción de PCR, sino también los factores "aislamiento de ADN" y "día de PCR" son factores importantes para la varianza total y, por lo tanto, deben incluirse en la validación interna. Se propone utilizar un modelo estadístico para estimar estos factores a partir de un gran conjunto de datos de validaciones iniciales, de modo que para métodos de OMG similares en el futuro, solo sea necesario validar el paso de PCR. Los datos resultantes se discuten a la luz de los criterios europeos acordados para los métodos de detección calificados de OGM.

To improve the efficacy of the in-house validation of GMO detection methods (DNA isolation and real-time PCR, polymerase chain reaction), a study was performed to gain insight in the contribution of the different steps of the GMO detection method to the repeatability and in-house reproducibility. In the present study, 19 methods for (GM) soy, maize canola and potato were validated in-house of which 14 on the basis of an 8-day validation scheme using eight different samples and five on the basis of a more concise validation protocol. In this way, data was obtained with respect to the detection limit, accuracy and precision. Also, decision limits were calculated for declaring non-conformance (>0.9%) with 95% reliability. In order to estimate the contribution of the different steps in the GMO analysis to the total variation variance components were estimated using REML (residual maximum likelihood method). From these components, relative standard deviations for repeatability and reproducibility (RSDr and RSDR) were calculated. The results showed that not only the PCR reaction but also the factors ‘DNA isolation’ and ‘PCR day’ are important factors for the total variance and should therefore be included in the in-house validation. It is proposed to use a statistical model to estimate these factors from a large dataset of initial validations so that for similar GMO methods in the future, only the PCR step needs to be validated. The resulting data are discussed in the light of agreed European criteria for qualified GMO detection methods.

Este artículo ilustra las ventajas que un método de agregación de base difusa podría aportar a la validación de un método múltiplex para la detección de OMG (kit DualChip OMG, Eppendorf). Se han desarrollado directrices para la validación de métodos químicos, bioquímicos, farmacéuticos y genéticos, y las estadísticas de validación ad hoc están disponibles y se utilizan de forma rutinaria para las pruebas internas y entre laboratorios y la toma de decisiones. La lógica difusa permite resumir la información obtenida mediante estadísticas de validación independientes en un indicador sintético del rendimiento general del método. La tecnología de micromatrices, introducida para la identificación simultánea de múltiples OGM, plantea problemas de validación específicos (patrones de desempeño para una variedad de OGM en diferentes concentraciones). En este documento se ilustra un indicador de base difusa para la evaluación general y se aplica a los datos de validación de diferentes elementos modificados genéticamente. Se hicieron comentarios sobre los resultados analíticos. Se demostró que las reglas basadas en lógica difusa son aplicables para mejorar la interpretación de los resultados y facilitar la evaluación general del método múltiplex.

This paper illustrates the advantages that a fuzzy-based aggregation method could bring into the validation of a multiplex method for GMO detection (DualChip GMO kit, Eppendorf). Guidelines for validation of chemical, bio-chemical, pharmaceutical and genetic methods have been developed and ad hoc validation statistics are available and routinely used, for in-house and inter-laboratory testing, and decision-making. Fuzzy logic allows summarising the information obtained by independent validation statistics into one synthetic indicator of overall method performance. The microarray technology, introduced for simultaneous identification of multiple GMOs, poses specific validation issues (patterns of performance for a variety of GMOs at different concentrations). A fuzzy-based indicator for overall evaluation is illustrated in this paper, and applied to validation data for different genetically modified elements. Remarks were drawn on the analytical results. The fuzzy-logic based rules were shown to be applicable to improve interpretation of results and facilitate overall evaluation of the multiplex method.

Los modelos actuales de dispersión de transgenes se centran en el flujo genético a través del polen y descuidan las semillas, un vehículo vital para el flujo genético en los centros de origen y diversidad de los cultivos. Analizamos la dispersión de transgenes de maíz a través de semillas en México, la cuna del cultivo. Métodos. Utilizamos inmunoensayos (ELISA) para detectar la actividad de proteínas recombinantes en una muestra nacional de semillas de agricultores. Estimamos parámetros críticos de la dinámica de la población de semillas utilizando datos de encuestas de hogares y combinamos estas estimaciones con resultados analíticos para examinar presuntas fuentes y mecanismos de dispersión. Resultados. Las proteínas recombinantes Cry1Ab/Ac y CP4/EPSPS se encontraron en el 3,1% y el 1,8% de las muestras, respectivamente. Son más abundantes en el sureste de México, pero también están presentes en la región centro-oeste. La difusión de semillas y granos importados de Estados Unidos podría explicar la frecuencia y distribución de los transgenes en el centro-oeste de México, pero no en el sureste. Conclusiones. Entender el potencial de supervivencia y dispersión de los transgenes debería ayudar a diseñar métodos para regular la difusión del germoplasma en las reservas locales de semillas. Se requiere mayor investigación sobre las interacciones entre los sistemas de semillas formales e informales y los mercados de granos en los centros de origen y diversificación de cultivos.

Current models of transgene dispersal focus on gene flow via pollen while neglecting seed, a vital vehicle for gene flow in centers of crop origin and diversity. We analyze the dispersal of maize transgenes via seeds in Mexico, the crop's cradle. Methods. We use immunoassays (ELISA) to screen for the activity of recombinant proteins in a nationwide sample of farmer seed stocks. We estimate critical parameters of seed population dynamics using household survey data and combine these estimates with analytical results to examine presumed sources and mechanisms of dispersal. Results. Recombinant proteins Cry1Ab/Ac and CP4/EPSPS were found in 3.1% and 1.8% of samples, respectively. They are most abundant in southeast Mexico but also present in the west-central region. Diffusion of seed and grain imported from the United States might explain the frequency and distribution of transgenes in west-central Mexico but not in the southeast. Conclusions. Understanding the potential for transgene survival and dispersal should help design methods to regulate the diffusion of germplasm into local seed stocks. Further research is needed on the interactions between formal and informal seed systems and grain markets in centers of crop origin and diversification.

Este documento revisa aspectos relevantes para la detección y cuantificación de material genéticamente modificado (GM) dentro de la cadena alimentaria/alimentaria. El marco regulatorio de cultivos GM a nivel internacional se evalúa con referencia a la trazabilidad y el etiquetado. Se revisan los métodos analíticos actuales para la detección, identificación y cuantificación de ADN transgénico en alimentos y forrajes. Estos métodos incluyen PCR cuantitativa en tiempo real, PCR multiplex y PCR multiplex en tiempo real. Se presta especial atención a los métodos capaces de identificar múltiples eventos GM en una sola reacción y al desarrollo de microdispositivos y microsensores, aunque no han sido totalmente validados para su aplicación.

This paper reviews aspects relevant to detection and quantification of genetically modified (GM) material within the feed/food chain. The GM crop regulatory framework at the international level is evaluated with reference to traceability and labelling. Current analytical methods for the detection, identification, and quantification of transgenic DNA in food and feed are reviewed. These methods include quantitative real-time PCR, multiplex PCR, and multiplex real-time PCR. Particular attention is paid to methods able to identify multiple GM events in a single reaction and to the development of microdevices and microsensors, though they have not been fully validated for application.

El objetivo del presente estudio fue evaluar la aplicabilidad del método específico de eventos MON 810 5′ validado por el Laboratorio Comunitario de Referencia para Alimentos y Forrajes Modificados Genéticamente que se usa comúnmente con fines cuantitativos. Este protocolo de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real del gen específico del evento/hmg-taxon 5 'junto con el análisis 2 ΔΔCT fue el enfoque elegido para determinar el número de copias de inserción MON 810 por genoma haploide en 26 variedades comerciales de maíz modificadas genéticamente. La variedad DK 513 que contenía una copia de integración por genoma haploide se utilizó como calibrador en cada ensayo. También se analizaron datos complementarios de PCR en tiempo real de punto final que se dirigieron específicamente al inserto MON 810. Los resultados globales evaluaron y garantizaron la integridad genética de la integración transgénica por genoma haploide para 24 de las 26 variedades comerciales estudiadas, que no mostraron diferencias significativas entre los valores de 2 ΔΔCT con respecto al valor del calibrador. Por el contrario, dos variedades no mostraron ningún inserto transgénico intacto en sus genomas. Este método analítico validado era adecuado para la detección y cuantificación del MON 810.

The objective of the present study was to assess the applicability of the MON 810 5′ event-specific method validated by the Community Reference Laboratory for Genetically Modified Food and Feed that is commonly used for quantitative purposes. This 5′ event-specific/hmg-taxon gene real-time polymerase chain reaction (PCR) protocol coupled to 2ΔΔCT analysis was the chosen approach to determine the MON 810 insert copy number per haploid genome across 26 genetically modified commercial maize varieties. Variety DK 513 containing one copy integration per haploid genome was used as calibrator in each assay. Complementary data from end-point real time PCRs that targeted specifically the MON 810 insert were also analyzed. Global results assessed and guaranteed the genetic intactness of the transgenic integration per haploid genome for 24 out of the 26 commercial varieties studied, which showed no significant differences between 2ΔΔCT values respect to the calibrator value. Conversely, two varieties showed no intact transgenic insert in their genomes. This validated analytical method was suitable for MON 810 detection and quantification purposes.

La reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real es actualmente el método elegido para cuantificar ácidos nucleicos en diferentes aplicaciones de cuantificación basadas en ADN. También se usa ampliamente para detectar y cuantificar componentes genéticamente modificados en alimentos y piensos, empleando predominantemente las químicas de PCR en tiempo real TaqMan® y SYBR® Green. En nuestro estudio, se evaluaron y compararon exhaustivamente cuatro químicas alternativas: Lux™, Plexor™, Cycling Probe Technology y LNA® utilizando la química TaqMan® como sistema de referencia. Los amplicones se diseñaron en el gen de la invertasa del maíz y la unión 5' del transgén insertado y el ADN genómico de la planta en el evento MON 810. Los ensayos en tiempo real se compararon posteriormente en cuanto a su eficacia en la amplificación por PCR, los límites de detección y cuantificación, la repetibilidad y la precisión para probar el rendimiento de los ensayos. Además, se verificó la especificidad de los ensayos establecidos en varias especies de plantas transgénicas y no transgénicas. Se evaluó la aplicabilidad general de los ensayos diseñados, agregando aspectos prácticos y de costos a las características de rendimiento. Aunque ninguna de las químicas superó significativamente a las demás, hay ciertas características que sugieren que la tecnología LNA® es una alternativa a TaqMan® cuando se diseñan ensayos para análisis cuantitativo. Debido a que las sondas LNA® son mucho más cortas, pueden ser especialmente apropiadas cuando se requiere una alta especificidad y donde el diseño de una sonda TaqMan® común es difícil o incluso imposible debido a las características de la secuencia. Plexor™, por otro lado, podría ser un método de elección para el análisis cualitativo cuando prevalecen la sensibilidad, el bajo costo y la simplicidad de uso.

The real-time polymerase chain reaction is currently the method of choice for quantifying nucleic acids in different DNA based quantification applications. It is widely used also for detecting and quantifying genetically modified components in food and feed, predominantly employing TaqMan® and SYBR® Green real-time PCR chemistries. In our study four alternative chemistries: Lux™, Plexor™, Cycling Probe Technology and LNA® were extensively evaluated and compared using TaqMan® chemistry as a reference system. Amplicons were designed on the maize invertase gene and the 5'-junction of inserted transgene and plant genomic DNA in MON 810 event. Real-time assays were subsequently compared for their efficiency in PCR amplification, limits of detection and quantification, repeatability and accuracy to test the performance of the assays. Additionally, the specificity of established assays was checked on various transgenic and non-transgenic plant species. The overall applicability of the designed assays was evaluated, adding practicability and costs issues to the performance characteristics. Although none of the chemistries significantly outperformed the others, there are certain characteristics that suggest that LNA® technology is an alternative to TaqMan® when designing assays for quantitative analysis. Because LNA® probes are much shorter they might be especially appropriate when high specificity is required and where the design of a common TaqMan® probe is difficult or even impossible due to sequence characteristics. Plexor™ on the other hand might be a method of choice for qualitative analysis when sensitivity, low cost and simplicity of use prevail.

Los ácidos nucleicos, especialmente el ADN, son objetivos de diagnósticos cualitativos y cuantitativos para organismos genéticamente modificados (OGM) en semillas, alimentos y piensos. La amplificación del ácido nucleico es un paso esencial para posteriores análisis de la secuencia diana. La PCR ha sido el método de elección para la amplificación de ADN en la mayoría de los laboratorios, y su versión en tiempo real (qPCR) también permite el análisis cuantitativo de los contenidos de destino. A pesar de sus numerosas ventajas, la tecnología PCR tiene algunas limitaciones, como la falta de verdaderas propiedades de multiplexación. Para paliar los inconvenientes relacionados con la tecnología PCR, se están desarrollando rápidamente métodos alternativos de amplificación de ácidos nucleicos con características prometedoras. Estos métodos, sus ventajas y los inconvenientes, que aún no están resueltos, se resumen en el artículo. Se presta especial atención a las posibilidades de utilizar estos métodos alternativos para la detección de OMG en el futuro, cuando la expansión de los OMG, tanto en diversidad como en frecuencia, dificulte el funcionamiento de los sistemas de detección de OMG actuales.

Nucleic acids, especially DNA, are targets of qualitative and quantitative diagnostics for genetically modified organisms (GMO) in seeds, food- and feedstuff. The amplification of the nucleic acid is an essential step for further analyses of the target sequence. The PCR has been the method of choice for DNA amplification in most laboratories, and its real-time version (qPCR) also enables quantitative analysis of target contents. Despite its numerous advantages, PCR technology has some limitations such as the lack of true multiplexing properties. To alleviate the drawbacks linked to PCR technology, alternative nucleic acid amplification methods with promising characteristics are being developed fast. These methods, their advantages, and the inconveniences, which are not yet resolved are summarized in the paper. Special focus is given to the possibilities of using these alternative methods for GMO detection in future, when expansion of GMOs both in diversity and frequencies will make current GMO detection systems difficult to operate.