Detección de organismos genéticamente modificados

Se han desarrollado varias técnicas para la detección y cuantificación de organismos genéticamente modificados, pero la PCR cuantitativa en tiempo real es, con mucho, el enfoque más popular. Entre las químicas de PCR en tiempo real más utilizadas se encuentran las sondas TaqMan y SYBR green, pero también se han desarrollado muchas otras químicas de detección. Debido a que su rendimiento nunca se ha comparado sistemáticamente, aquí presentamos una evaluación exhaustiva de algunas químicas prometedoras: colorantes de marcado de ADN no específicos de secuencia (verde SYBR), tecnologías basadas en cebadores (cebadores AmpliFluor, Plexor, Lux) y técnicas que involucran cebadores doblemente marcados. sondas, que comprenden sondas de hibridación (baliza molecular) e hidrólisis (TaqMan, CPT, LNA y MGB), basadas en datos experimentales publicados recientemente. Para cada una de las químicas de detección se incluyeron ensayos dirigidos a loci seleccionados. Las químicas de PCR en tiempo real se compararon posteriormente en cuanto a su eficiencia en la amplificación de PCR y los límites de detección y cuantificación. Se evaluó la aplicabilidad general de los productos químicos, agregando aspectos prácticos y de costo a las características de desempeño. Ninguna de las químicas parecía ser significativamente mejor que otra, pero ciertas características favorecen la tecnología LNA y MGB como buenas alternativas a TaqMan en los ensayos de cuantificación. Los ensayos SYBR green y molecular beacon pueden funcionar igual de bien, pero es posible que necesiten más optimización antes de su uso.

Several techniques have been developed for detection and quantification of genetically modified organisms, but quantitative real-time PCR is by far the most popular approach. Among the most commonly used real-time PCR chemistries are TaqMan probes and SYBR green, but many other detection chemistries have also been developed. Because their performance has never been compared systematically, here we present an extensive evaluation of some promising chemistries: sequence-unspecific DNA labeling dyes (SYBR green), primer-based technologies (AmpliFluor, Plexor, Lux primers), and techniques involving double-labeled probes, comprising hybridization (molecular beacon) and hydrolysis (TaqMan, CPT, LNA, and MGB) probes, based on recently published experimental data. For each of the detection chemistries assays were included targeting selected loci. Real-time PCR chemistries were subsequently compared for their efficiency in PCR amplification and limits of detection and quantification. The overall applicability of the chemistries was evaluated, adding practicability and cost issues to the performance characteristics. None of the chemistries seemed to be significantly better than any other, but certain features favor LNA and MGB technology as good alternatives to TaqMan in quantification assays. SYBR green and molecular beacon assays can perform equally well but may need more optimization prior to use.

Se ha desarrollado un método cuantitativo rápido en el sitio o cerca del mismo para usar como una decisión predictiva previa a la cosecha o como una herramienta de monitoreo de la coexistencia para detectar la presencia accidental de organismos modificados genéticamente (GM). Basado en un protocolo basado en laboratorio para la cuantificación en tiempo real (RT) del evento MON810 GM en granos de maíz, el método de reacción en cadena de la polimerasa dúplex RT se construyó alrededor de la plataforma portátil Cepheid SmartCyclerII, que requiere solo una infraestructura de soporte modesta para la aplicación de campo. La validación a través de un ensayo interlaboratorio internacional mostró un buen cumplimiento de los requisitos mínimos de rendimiento del ensayo definidos por la Red Europea de Laboratorios de OMG (RSDr = 18,5 %; RSDR = 32,8; Bias = 26,7 %).

A rapid on-, or near-site, quantitative method for use as a pre-harvest predictive decision, or co-existence monitoring, tool for adventitious genetically modified (GM) presence has been developed. Based on a laboratory-based protocol for real-time (RT) quantification of the MON810 GM event in maize kernels, the duplex RT polymerase chain reaction method was constructed around the portable Cepheid SmartCyclerII platform, requiring only modest support infrastructure for field application. Validation through an international ring trial showed good compliance with minimum assay performance requirements as defined by the European Network of GMO Laboratories (RSDr = 18.5%; RSDR = 32.8; Bias = 26.7%).

El enfoque modular para el análisis de organismos genéticamente modificados (OGM) se basa en la independencia de los módulos combinados (es decir, extracción de ADN y cuantificación de GM). La validez de esta suposición debe probarse sobre la base de criterios de desempeño específicos. Se llevó a cabo un experimento utilizando, como referencia, el módulo de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) cuantitativo en tiempo real validado para la detección de soja transgénica (RRS) Roundup Ready® tolerante al glifosato. Se utilizaron diferentes módulos de extracción de ADN (CTAB, Wizard y Dellaporta) para extraer ADN de diferentes matrices de alimentos/forrajes (forrajes, galletas y material de referencia certificado [CRM 1%]) que contenían el objetivo del módulo de PCR en tiempo real utilizado para la validación. La pureza y la integridad estructural (ausencia de inhibición) se utilizaron como criterios básicos que debe cumplir un módulo de extracción de ADN para proporcionar un molde de ADN adecuado para el análisis cuantitativo de OMG basado en PCR en tiempo real (RT). Cuando se aplicaron criterios de rendimiento (eliminación de extractos de ADN no conformes), se demostró estadísticamente la independencia de la cuantificación de OGM del método de extracción y la matriz, excepto en el caso de Wizard aplicado a la galleta. Un procedimiento basado en lógica difusa también confirmó el rendimiento relativamente bajo de la combinación Asistente/galleta. Para RRS, este estudio reconoce que la modularidad puede ser generalmente aceptada, con la limitación de evitar combinar material altamente procesado (es decir, galletas) con un sistema de perlas magnéticas (es decir, Wizard).

The modular approach to analysis of genetically modified organisms (GMOs) relies on the independence of the modules combined (i.e. DNA extraction and GM quantification). The validity of this assumption has to be proved on the basis of specific performance criteria. An experiment was conducted using, as a reference, the validated quantitative real-time polymerase chain reaction (PCR) module for detection of glyphosate-tolerant Roundup Ready® GM soybean (RRS). Different DNA extraction modules (CTAB, Wizard and Dellaporta), were used to extract DNA from different food/feed matrices (feed, biscuit and certified reference material [CRM 1%]) containing the target of the real-time PCR module used for validation. Purity and structural integrity (absence of inhibition) were used as basic criteria that a DNA extraction module must satisfy in order to provide suitable template DNA for quantitative real-time (RT) PCR-based GMO analysis. When performance criteria were applied (removal of non-compliant DNA extracts), the independence of GMO quantification from the extraction method and matrix was statistically proved, except in the case of Wizard applied to biscuit. A fuzzy logic-based procedure also confirmed the relatively poor performance of the Wizard/biscuit combination. For RRS, this study recognises that modularity can be generally accepted, with the limitation of avoiding combining highly processed material (i.e. biscuit) with a magnetic-beads system (i.e. Wizard).

Se detectaron niveles de toxina Cry1Ab en maíz modificado genéticamente del evento genético MON 810 frente a maíz casi isogénico como control negativo mediante dos inmunoensayos comerciales. Los inmunoensayos se caracterizaron por su reactividad cruzada (CR) entre la protoxina Cry1Ab y la toxina activada, y se compararon entre sí para la detección de la toxina en una muestra vegetal de referencia. Los niveles de toxina Cry1Ab, corregidos para el contenido de toxina activa utilizando los valores de CR obtenidos, se monitorizaron en el maíz DK-440 BTY durante todo el periodo vegetativo. Se observó que la concentración de toxina mostraba un rápido aumento en las hojas hasta 17,15 ± 1,66 µg/g al final de la quinta semana de cultivo, seguido de un descenso gradual hasta 9,61 ± 2,07 µg/g en la semana 16 y un ligero aumento de nuevo hasta 13,51 ± 1,96 µg/g durante las 2 últimas semanas debido a la desecación parcial. En las raíces se observó una fluctuación similar pero menor de los niveles de toxina entre 5,32 ± 0,49 µg/g en la fase V1 menos diferenciada y 2,25 ± 0,30 µg/g durante el desarrollo de la planta. En cambio, los niveles de toxina Cry1Ab parecían ser estables: 1,36 ± 0,45, 4,98 ± 0,31, 0,47 ± 0,03 y 0,83 ± 0,15 µg/g en el tallo, la pared de la antera, el polen y el grano, respectivamente. Las concentraciones de toxinas producidas en los estadios fenológicos VT-R4 en condiciones reales de cultivo se compararon entre sí en tres años diferentes dentro de un período de 8 años.

Levels of Cry1Ab toxin were detected in genetically modified maize of genetic event MON 810 against near isogenic maize as negative control by two commercial immunoassays. The immunoassays were characterized for their cross-reactivity (CR) between Cry1Ab protoxin and activated toxin, and were compared with each other for toxin detection in a reference plant sample. Cry1Ab toxin levels, corrected for active toxin content using the CR values obtained, were monitored in maize DK-440 BTY through the entire vegetation period. The toxin concentration was found to show a rapid rise in the leaves to 17.15 ± 1.66 µg/g by the end of the fifth week of cultivation, followed by a gradual decline to 9.61 ± 2.07 µg/g by the 16th week and a slight increase again to 13.51 ± 1.96 µg/g during the last 2 weeks due to partial desiccation. Similar but lesser fluctuation of toxin levels was seen in the roots between 5.32 ± 0.49 µg/g at the less differentiated V1 stage and 2.25 ± 0.30 µg/g during plant development. In contrast, Cry1Ab toxin levels appeared to be stably 1.36 ± 0.45, 4.98 ± 0.31, 0.47 ± 0.03, and 0.83 ± 0.15 µg/g in the stem, anther wall, pollen, and grain, respectively. Toxin concentrations produced at the VT-R4 phenological stages under actual cultivation conditions were compared with each other in three different years within an 8-year period.

Un ensayo de referencia PCR fiable para la cuantificación relativa de organismos modificados genéticamente (OMG) debe ser específico para el taxón objetivo y amplificar uniformemente a lo largo de las variedades comercializadas dentro del taxón considerado. En los métodos oficiales de cuantificación de OMG se utilizan diferentes ensayos de referencia para el maíz (Zea mays L.). En este estudio, evaluamos la fiabilidad de ocho ensayos de referencia existentes para el maíz, cuatro de los cuales se utilizan en combinación con un ensayo de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) específico para cada evento, validado y publicado por el Laboratorio Comunitario de Referencia (LCR). Se analizó la variación de la secuencia de nucleótidos en las regiones genómicas diana en una amplia gama de variedades y líneas transgénicas y convencionales: variedades MON 810 cultivadas en España y variedades convencionales de diversos orígenes geográficos e historial de mejora. Además, se evaluó la fiabilidad de los ensayos basándose en su rendimiento de amplificación por PCR. Se observó una sustitución de un solo par de bases, correspondiente a un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) notificado en un estudio anterior, en el cebador directo de uno de los ensayos de alcohol deshidrogenasa 1 (Adh1) (70) estudiados en un gran número de variedades. La presencia del SNP es coherente con un rendimiento deficiente de la PCR observado para este ensayo a lo largo de las variedades examinadas. Los datos obtenidos muestran que el ensayo Adh1 (70) utilizado en el ensayo oficial CRL NK603 no es fiable. Basándonos en nuestros resultados, tanto del estudio de estabilidad nucleotídica como de la prueba de rendimiento de la PCR, podemos concluir que el ensayo de referencia Adh1 (136) (ensayos T25 y Bt11), así como el ensayo del gen de la proteína del grupo de alta movilidad analizado, que también forman parte de los métodos de cuantificación del CRL, son altamente fiables. A pesar de la uniformidad observada en la secuencia de nucleótidos del ensayo del gen de la invertasa, la prueba de rendimiento de la PCR revela que esta secuencia diana podría presentarse en más de una copia. Por último, aunque actualmente no forman parte de los métodos oficiales de cuantificación, los ensayos de zeína y SSIIb resultan altamente fiables en términos de estabilidad nucleotídica y rendimiento de la PCR y se proponen como buenas dianas alternativas para un ensayo de referencia para el maíz.

A reliable PCR reference assay for relative genetically modified organism (GMO) quantification must be specific for the target taxon and amplify uniformly along the commercialised varieties within the considered taxon. Different reference assays for maize (Zea mays L.) are used in official methods for GMO quantification. In this study, we evaluated the reliability of eight existing maize reference assays, four of which are used in combination with an event-specific polymerase chain reaction (PCR) assay validated and published by the Community Reference Laboratory (CRL). We analysed the nucleotide sequence variation in the target genomic regions in a broad range of transgenic and conventional varieties and lines: MON 810 varieties cultivated in Spain and conventional varieties from various geographical origins and breeding history. In addition, the reliability of the assays was evaluated based on their PCR amplification performance. A single base pair substitution, corresponding to a single nucleotide polymorphism (SNP) reported in an earlier study, was observed in the forward primer of one of the studied alcohol dehydrogenase 1 (Adh1) (70) assays in a large number of varieties. The SNP presence is consistent with a poor PCR performance observed for this assay along the tested varieties. The obtained data show that the Adh1 (70) assay used in the official CRL NK603 assay is unreliable. Based on our results from both the nucleotide stability study and the PCR performance test, we can conclude that the Adh1 (136) reference assay (T25 and Bt11 assays) as well as the tested high mobility group protein gene assay, which also form parts of CRL methods for quantification, are highly reliable. Despite the observed uniformity in the nucleotide sequence of the invertase gene assay, the PCR performance test reveals that this target sequence might occur in more than one copy. Finally, although currently not forming a part of official quantification methods, zein and SSIIb assays are found to be highly reliable in terms of nucleotide stability and PCR performance and are proposed as good alternative targets for a reference assay for maize.

Para investigar la degradación relativa y el patrón de fragmentación de la proteína Cry1Ab recombinante del maíz genéticamente modificado (GM) MON810 a lo largo del tracto gastrointestinal (GIT) de vacas lecheras, se llevó a cabo un estudio de alimentación con maíz GM durante 25 meses en 36 vacas Fleckvieh de Baviera en lactación, distribuidas en dos grupos (18 vacas por grupo) alimentadas con dietas que contenían maíz GM MON810 o maíz no GM casi isogénico como componentes respectivos de la dieta. Todas las vacas fueron alimentadas con una ración mixta total parcial (pTMR). Durante el ensayo de alimentación, se recogieron 8 muestras de alimento (4 transgénicas (T) y 4 no transgénicas (NT) pTMR) y 42 muestras de heces (26 T y 18 NT) del subconjunto de vacas alimentadas con dietas T y NT, y al final del ensayo de alimentación, se recogió el contenido de digesta del rumen, abomaso, intestino delgado, intestino grueso y ciego tras el sacrificio de seis vacas de cada grupo de alimentación. Se analizaron las muestras para determinar la proteína Cry1Ab y la proteína total mediante ELISA específico para Cry1Ab y el ensayo del ácido bicinchonínico, respectivamente. Se realizaron análisis de inmunoblot para evaluar la integridad de la proteína Cry1Ab en las muestras de pienso, digesta y heces. Se registró una disminución del 44% en la concentración de proteína Cry1Ab desde T pTMR hasta las heces evacuadas (9,40 frente a 4,18 μg/g de proteínas totales). Las concentraciones de proteína Cry1Ab en la digesta GIT de las vacas alimentadas con dietas T variaron entre los 0,38 μg/g de proteínas totales más bajos en el abomaso y los 3,84 μg/g de proteínas totales más altos en el rumen. El análisis de inmunoblot reveló la degradación extensiva de la proteína Cry1Ab recombinante en un fragmento más pequeño de alrededor de 34 kDa en GIT. Los resultados del presente estudio indican que la proteína Cry1Ab recombinante de MON810 se degrada cada vez más en un fragmento pequeño durante la digestión de las vacas lecheras.

To investigate the relative degradation and fragmentation pattern of the recombinant Cry1Ab protein from genetically modified (GM) maize MON810 throughout the gastrointestinal tract (GIT) of dairy cows, a 25 months GM maize feeding study was conducted on 36 lactating Bavarian Fleckvieh cows allocated into two groups (18 cows per group) fed diets containing either GM maize MON810 or nearly isogenic non-GM maize as the respective diet components. All cows were fed a partial total mixed ration (pTMR). During the feeding trial, 8 feed (4 transgenic (T) and 4 non-transgenic (NT) pTMR) and 42 feces (26 T and 18 NT) samples from the subset of cows fed T and NT diets, and at the end of the feeding trial, digesta contents of rumen, abomasum, small intestine, large intestine and cecum were collected after the slaughter of six cows of each feeding group. Samples were analyzed for Cry1Ab protein and total protein using Cry1Ab specific ELISA and bicinchoninic acid assay, respectively. Immunoblot analyses were performed to evaluate the integrity of Cry1Ab protein in feed, digesta and feces samples. A decrease to 44% in Cry1Ab protein concentration from T pTMR to the voided feces (9.40 versus 4.18 μg/g of total proteins) was recorded. Concentrations of Cry1Ab protein in GIT digesta of cows fed T diets varied between the lowest 0.38 μg/g of total proteins in abomasum to the highest 3.84 μg/g of total proteins in rumen. Immunoblot analysis revealed the extensive degradation of recombinant Cry1Ab protein into a smaller fragment of around 34 kDa in GIT. The results of the present study indicate that the recombinant Cry1Ab protein from MON810 is increasingly degraded into a small fragment during dairy cow digestion.

La detección y la identificación de organismos genéticamente modificados (OGM) en semillas, granos y otros materiales están impulsadas por requisitos legales y demandas comerciales. En los Reglamentos de alimentos y piensos de la UE [Reg. (CE) n.º 1829/2003, reg. (CE) n.° 1830/2003] exigen el etiquetado obligatorio de todos los productos derivados de OMG, incluidos los productos a granel, las semillas tanto para el consumo humano como para la alimentación animal. El Reglamento sobre alimentos y piensos establece en el 0,9 % el umbral para la presencia accidental de materiales derivados de OGM autorizados y en el 0 % para los OMG no autorizados. Para probar la cantidad de OGM de manera consistente y reproducible, se requieren métodos analíticos adecuados. Además, también se requiere un etiquetado obligatorio para aquellos productos en los que el ADN o las proteínas derivadas de OGM ya no son detectables, como en el caso de los aceites altamente refinados. Además, debe garantizarse la trazabilidad de los OGM en todos los productos elaborados a partir de OMG en todas las etapas de su comercialización a lo largo de la cadena de producción y distribución, tal como exige el Reg. (CE) n.º 1830/2003. En el proceso de autorización de OGM, los solicitantes deben proporcionar a las autoridades competentes un método específico para la detección e identificación del evento de transformación. En tal sentido, el Laboratorio Comunitario de Referencia para Alimentos y Piensos GM (CRL-GMFF) (establecido por Reg. (EC) No 1830/2003), tiene el mandato de validar los métodos proporcionados por los productores de OGM (http://gmo -crl.jrc.it/). Todos los métodos validados por CRL-GMFF están publicados en el Registro de GM (http://ec.europa.eu/food/food/biotechnology/authorisation/index_en.htm). Otros métodos para la detección de OGM están anexados a estándares internacionales (ISO 21569:2005, ISO 21570:2005, ISO 21572:2005). En este sentido, y como medida para implementar la legislación y facilitar a las partes interesadas la recuperación rápida de métodos, se ha establecido y mantenido una base de datos integral de métodos en la Unidad de Biotecnología y OGM del Instituto de Salud y Protección del Consumidor (IHCP) de la Comisión Europea, cuyo objetivo es en la difusión de información sobre métodos validados para la detección y cuantificación de OGM

The detection and the identification of genetically modified organisms (GMOs) in seeds, grains and other materials are driven by legal requirements and marketing demands. In the EU food and feed Regulations [Reg. (EC) No 1829/2003, Reg. (EC) No 1830/2003] require compulsory labeling for all GMO-derived products including bulk commodities, seeds both for human consumption and animal feeding. The food and feed Regulation sets to 0.9% the threshold for the adventitious presence of authorized GMO-derived materials and 0% for non-authorized GMOs. In order to test the amount of GMOs in a consistent and reproducible way suitable analytical methods are required. Moreover, mandatory labeling is also required for those products where GMO-derived DNA or proteins are no longer detectable as for highly refined oils. In addition, traceability of GMOs has to be guaranteed in all products produced from GMOs at all stages of their placing on the market through the production and distribution chain as required by Reg. (EC) No 1830/2003.In the process of GMO authorization an event-specific method for detection and identification of the transformation event must be provided by the applicants to the competent Authorities. In such respect, the Community Reference Laboratory for GM Food and Feed (CRL-GMFF) (established by Reg. (EC) No 1830/2003), has the mandate to validate the methods provided by the GMOs producers (http://gmo-crl.jrc.it/). All the CRL-GMFF validated methods are published in the GM Register (http://ec.europa.eu/food/food/biotechnology/authorisation/index_en.htm).Other methods for detection of GMOs are annexed to international standards (ISO 21569:2005, ISO 21570:2005, ISO 21572:2005). In this respect, and as a measure to implement legislation and facilitate stakeholders in quick retrieval of methods, a comprehensive database of methods has been established and maintained at Biotechnology and GMOs Unit of the European Commissions Institute for Health and Consumer Protection (IHCP), aimed at the diffusion of information on validated methods for detection and quantification of GMOs

El uso de nueva tecnología combina rasgos de varias especies y esto ha generado preocupaciones sobre el impacto al medio ambiente y la amenaza que los OGM representan para la salud humana. En consecuencia, se han introducido medidas legislativas y se han establecido los correspondientes sistemas de regulación y control.

The use of new technology combines traits from various species and this has raised concerns about the impact on the environment and the threat that GMOs pose to human health. Consequently, legislative measures have been introduced and the corresponding regulation and control systems have been established.

La comercialización de numerosos organismos genéticamente modificados (OGM) ya ha sido aprobada en todo el mundo y varios OGM adicionales están en proceso de aprobación. Muchos países han adoptado legislación para abordar cuestiones relacionadas con los OGM, como la seguridad alimentaria, las preocupaciones ambientales y el derecho de elección de los consumidores, lo que hace que la trazabilidad de los OGM sea una necesidad. El creciente alcance de las pruebas de OGM hace que sea importante estudiar estrategias óptimas de detección e identificación de OGM. Este documento define formalmente el problema del seguimiento rutinario de OGM a nivel de laboratorio como un problema de optimización de costos, proponiendo así un cambio de "la misma estrategia para todas las muestras" a "estrategias de prueba de OGM centradas en muestras". Se propone un algoritmo (GMOtrack) para encontrar estrategias de prueba óptimas de dos fases (detección-identificación). Se demuestran las ventajas de la optimización de costos con el aumento de la presencia de OGM en el mercado, lo que demuestra que los enfoques de optimización para la trazabilidad analítica de OGM pueden generar importantes reducciones de costos. Las estrategias de prueba óptimas dependen del laboratorio, ya que los costos dependen de las probabilidades previas de presencia local de OGM, que se ejemplifican en muestras de alimentos y forrajes. El enfoque GMOtrack propuesto, disponible públicamente bajo los términos de la Licencia Pública General, puede extenderse a otros dominios donde se involucran pruebas complejas, como la seguridad y la garantía de calidad en la cadena de suministro de alimentos.

Commercialization of numerous genetically modified organisms (GMOs) has already been approved worldwide, and several additional GMOs are in the approval process. Many countries have adopted legislation to deal with GMO-related issues such as food safety, environmental concerns, and consumers' right of choice, making GMO traceability a necessity. The growing extent of GMO testing makes it important to study optimal GMO detection and identification strategies. This paper formally defines the problem of routine laboratory-level GMO tracking as a cost optimization problem, thus proposing a shift from "the same strategy for all samples" to "sample-centered GMO testing strategies." An algorithm (GMOtrack) for finding optimal two-phase (screening-identification) testing strategies is proposed. The advantages of cost optimization with increasing GMO presence on the market are demonstrated, showing that optimization approaches to analytic GMO traceability can result in major cost reductions. The optimal testing strategies are laboratory-dependent, as the costs depend on prior probabilities of local GMO presence, which are exemplified on food and feed samples. The proposed GMOtrack approach, publicly available under the terms of the General Public License, can be extended to other domains where complex testing is involved, such as safety and quality assurance in the food supply chain.

Las variedades de canola, algodón, maíz y soja derivadas de la biotecnología se están cultivando en EE. UU., Canadá y otros países predominantemente exportadores de cereales. Aunque la cantidad de tierras de cultivo dedicadas a la producción de cultivos derivados de la biotecnología continúa aumentando, las preocupaciones persistentes de que pueden ocurrir consecuencias no deseadas justifican que la UE y la mayoría de los países importadores de granos regulen estos cultivos. La legislación de la UE exige la trazabilidad de los cereales/semillas oleaginosas, alimentos y piensos, y el etiquetado, cuando se demuestra la presencia de un nivel umbral del 0,9 % p/p de un rasgo modificado genéticamente en una muestra analítica. El contenido de GE se determina de forma rutinaria mediante PCR cuantitativa (qPCR) y el ADN genómico de la planta proporciona la plantilla para los pasos iniciales de este proceso. Existe una plétora de métodos de extracción de ADN para aplicaciones de qPCR. Es necesario implementar métodos estandarizados para la detección de rasgos modificados genéticamente para facilitar la comercialización de granos. El borrador del estándar 21571 de la Organización Internacional para la Estandarización identifica métodos basados ​​en detergentes y kits disponibles comercialmente que se usan ampliamente para la extracción de ADN, pero también indica que pueden ser necesarias adaptaciones dependiendo de la matriz de la muestra. Esta revisión evalúa las ventajas y desventajas de varios kits de extracción de ADN disponibles comercialmente, así como las modificaciones a los métodos de bromuro de cetiltrimetilamonio publicados. Los inhibidores son un obstáculo importante para la amplificación eficiente en qPCR. Se discuten los tipos de inhibidores de la PCR y las técnicas para minimizar la inhibición. Finalmente, la cuantificación precisa de ADN para aplicaciones en qPCR no es trivial. Muchos factores de confusión contribuyen a las diferencias en las mediciones analíticas cuando se aplica un método de cuantificación de ADN en particular y los diferentes métodos no siempre brindan resultados concordantes en la misma muestra de ADN. Se considera cómo estas diferencias afectan la incertidumbre de medición en qPCR.

Biotechnology-derived varieties of canola, cotton, corn and soybean are being grown in the USA, Canada and other predominantly grain exporting countries. Although the amount of farmland devoted to production of biotechnology-derived crops continues to increase, lingering concerns that unintended consequences may occur provide the EU and most grain-importing countries with justification to regulate these crops. Legislation in the EU requires traceability of grains/oilseeds, food and feed products, and labelling, when a threshold level of 0.9% w/w of genetically engineered trait is demonstrated to be present in an analytical sample. The GE content is routinely determined by quantitative PCR (qPCR) and plant genomic DNA provides the template for the initial steps in this process. A plethora of DNA extraction methods exist for qPCR applications. Implementing standardized methods for detection of genetically engineered traits is necessary to facilitate grain marketing. The International Organization for Standardization draft standard 21571 identifies detergent-based methods and commercially available kits that are widely used for DNA extraction, but also indicates that adaptations may be necessary depending upon the sample matrix. This review assesses advantages and disadvantages of various commercially available DNA extraction kits, as well as modifications to published cetyltrimethylammonium bromide methods. Inhibitors are a major obstacle for efficient amplification in qPCR. The types of PCR inhibitors and techniques to minimize inhibition are discussed. Finally, accurate quantification of DNA for applications in qPCR is not trivial. Many confounders contribute to differences in analytical measurements when a particular DNA quantification method is applied and different methods do not always provide concordant results on the same DNA sample. How these differences impact measurement uncertainty in qPCR is considered.